人工蝉花多糖对三黄鸡免疫功能及部分相关因子基因表达的影响

刘素贞，李瑞萍，刘长国，卢立志,,李国勤,田勇，柴一秋，姚火春

(1. 南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095；2.温州科技职业学院动物科学学院，浙江 温州 325000；3. 浙江农林大学动物科技学院，浙江 杭州 311300；4. 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310021；5. 浙江省亚热带作物研究所/温州市虫生真菌资源研究与开发重点实验室，浙江 温州 325005)

目前，细菌抗药性问题给人类带来了严重的威胁，为了维护动物源性食品安全和公共卫生安全，农业农村部提出加强药物的监督管理工作，逐步停止除中草药外的促生长类药物饲料添加剂的使用，倡导开发新型饲料添加剂替代抗菌促生长类饲料添加剂[1-3]。

我国中药材资源丰厚，开发新型中草药具有广泛的发展空间。研究表明，植物多糖具有提高机体免疫力、抗菌、抗病毒等多种作用[4-5]，因此多糖对动物机体免疫调节活性的研究成为热点[6]。蝉花富产于浙江、四川等地，含有多种糖原、生物碱、蛋白质等成分，其中以多糖类和蛋白质为主。

蝉花具有抵抗肿瘤、抗氧化等药理作用[7]，但对鸡的药理作用尚未见报道。野生蝉花资源稀少，人工培养蝉花与野生蝉花成分相似，多糖、虫草酸、必需氨基酸等高于野生蝉花[8]。浙江亚热带作物研究所通过人工培养技术获得蝉花不同产品，其中有：蝉花菌丝体和蝉花多糖(从蝉花菌丝体中提取所得的蝉花粗多糖，蝉花菌丝体中蝉花多糖的提取得率为14.2%)，蝉花多糖的生产成本大约是蝉花菌丝体的7倍多。与野生蝉花相比，这2种产品具有价格低、更容易产业化等特点。本试验在前期试验基础上，选取人工培养的蝉花中富含多糖成分的2种产品作为饲料添加剂[9]，通过研究其对生态放养三黄鸡体液免疫水平、细胞因子水平及与免疫相关因子干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)等mRNA表达变化，分析蝉花多糖、蝉花菌丝体对禽流感免疫的作用，进而为养鸡业绿色生态发展、推广应用性价比高的蝉花产品提供试验数据。

1 材料与方法

1.1 试验药物

蝉花多糖(多糖含量44.6%)、蝉花菌丝体干燥物(多糖提取得率为14.2%)， 均由浙江省亚热带作物研究所提供；禽流感疫苗(H5-Re8+H7N9)购自哈药集团有限公司。

1.2 主要试剂

IL-2、IL-4、IFN-γ、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等试剂盒(北京瑞格博科技发展有限公司)，禽流感标准阳性血清、阴性血清及禽流感病毒血凝抑制抗原(杭州杰萌动物疫病防控科技有限公司)，总RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒(Aidlab，北京)。

1.3 试验设计

1日龄雏鸡1 500只，随机分为3组，每组500只，其中：对照组饲喂基础饲粮，蝉花多糖组在基础饲粮中按0.5 g/kg添加蝉花多糖(相当于添加蝉花粗多糖1.12 g/kg)，蝉花菌丝体组在基础饲粮中按20 g/kg添加蝉花菌丝体(相当于添加蝉花粗多糖2.84 g/kg)。试验期为51 d。

1.4 饲养管理

鸡群自由摄食饮水，每天早晚添加相应的饲料2次。地面散养，自然光照，每天观察鸡采食及精神状态。饲料由温州正泰农牧有限公司提供，基础饲粮组成及营养水平见表1。5日龄法氏囊疫苗饮水免疫，13日龄新城疫活疫苗点眼免疫，19日龄禽流感疫苗肌肉注射，29日龄新城疫活疫苗点眼免疫，45日龄新城疫活疫苗点眼免疫。

1.5 检测指标和方法

1.5.1 禽流感抗体水平检测

在27、37、51日龄(即首免后1、2.5和4.5周)每组抽取20只试验鸡翅静脉采血，3 500 r/min离心5 min，抽取上层血清放置-20℃保存备检。依据《高致病性禽流感诊断技术》(GB/T 18936—2003)采用微量HI试验方法测定禽流感抗体水平[10]。

1.5.2 细胞因子含量测定

血样采集及处理同1.5.1。ELISA测定血清样本TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4含量，详细步骤参考试剂盒说明书。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.5.3 基因表达差异检测

51日龄时，每组随机抽取3只，采血完毕后迅速剖杀，无菌采取脾脏，放入冻存管并保存于液氮，后转移至-80 ℃冰箱待基因表达检测。全部脾脏组织样品总RNA参照试剂盒操作说明进行，检测RNAOD值，计算浓度，通过A260/A280比值检测纯度。组织样品cDNA反转录参照试剂盒操作说明进行，-80 ℃保存。

使用荧光定量PCR试剂盒，反应体系为10 μL：2×SYBR®Green Supermix 5.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板 1.0 μL，RNase Free dH2O补足至10.0 μL。反应程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，根据表2中引物退火温度58 ℃退火30 s，39个循环；融解曲线分析程序为60～95 ℃，每循环一次增加1 ℃，持续4 s。以Actin为内参基因，对目的基因IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4的mRNA表达量进行检测分析。各基因和内参基因引物序列详见表2，引物由北京百迈客生物科技有限公司合成。

1.6 数据处理与统计分析

采用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析，组间采用LDS法进行差异性显著性检验。试验数据用“平均值±标准误”表示。

表2 引物序列

2 结果

2.1 蝉花多糖对禽流感抗体水平的影响

由表3可知，51日龄时，蝉花菌丝体组的H5-Re8抗体水平较对照组有所升高(P<0.05)，27～51日龄，对照组H5-Re8抗体水平在3组中下降最快，而蝉花菌丝体组下降最慢。27～51日龄，各组H7N9抗体水平都呈先升后降的趋势，蝉花多糖组和蝉花菌丝体组H7N9抗体水平峰值较对照组更高；在37～51日龄，对照组H7N9抗体水平下降了7.1%，而蝉花菌丝体组的H7N9抗体水平仅仅下降了3.4%。表明在饲料中添加蝉花多糖不仅不同程度地提高了禽流感抗体水平，而且将抗体水平维持了更长的时间。

表3 27～51日龄各组鸡 H5-Re8、H7N9抗体水平 log2

2.2 蝉花多糖对血清细胞因子水平的影响

由表4可知，蝉花多糖组51日龄IL-1含量显著高于对照组；蝉花多糖组、蝉花菌丝体组IL-2含量较对照组都有不同程度上升(P>0.05)；27日龄，蝉花多糖组IL-4含量显著高于对照组和蝉花菌丝体组(P<0.05)，51日龄，蝉花菌丝体组IL-4含量最高，且蝉花多糖组和蝉花菌丝体组均显著高于对照组(P<0.05)；27、51日龄，蝉花多糖组、蝉花菌丝体组IL-6含量与对照组相比有所升高(P>0.05)； 27日龄，蝉花多糖组、蝉花菌丝体组IFN-γ含量比对照组显著升高(P<0.05)；蝉花多糖组、蝉花菌丝体组27～51日龄TNF-α含量较对照组有不同程度上升，其中27、51日龄蝉花多糖组、37日龄蝉花菌丝体组均比对照组显著升高(P<0.05)。

结果显示，通过添加蝉花多糖，机体可诱导分泌IL-4、TNF-α等多种细胞因子参与细胞免疫，IL-4等细胞因子介导体液免疫，两者在平衡状态下，能有效维持和提高机体免疫功能水平[11]。

表4 蝉花多糖对血清细胞因子水平的影响 pg/mL

2.3 蝉花多糖对免疫相关基因表达量的影响

根据图1可知，蝉花多糖组和蝉花菌丝体组脾脏细胞TNF-α、IL-2表达均有所降低，且TNF-α的表达显著低于对照组(P<0.05)；蝉花菌丝体可促进脾脏细胞IFN-γ、IL-4的表达，但与对照组均无显著差异(P>0.05)。

注：相同基因组间比较，无字母或字母相同表示差异不显著(P>0.05)，不同表示差异显著(P<0.05)

3 讨论

3.1 蝉花多糖对三黄鸡禽流感抗体水平的影响

前期试验表明，蝉花多糖能提高雏鸡新城疫疫苗免疫抗体水平和成活率[12]。禽业致命的打击除了鸡新城疫还有禽流感病毒，中草药多糖能调节免疫功能、提高机体对外来侵入病菌的抵抗力，且具有毒副作用小等优点[13]。本试验结果显示蝉花菌丝体组禽流感H5抗体水平显著高于对照组，提示蝉花多糖可能有提高动物机体体液免疫的作用。刘娜等[14]研究发现，松花粉多糖对禽流感的免疫有增强作用。

3.2 蝉花多糖对三黄鸡血清细胞因子水平的影响

白细胞介素参与机体内多种生理病理过程[15]。Th1类细胞调节细胞免疫，参与机体抗毒、抗癌；Th2类细胞是参加体液免疫，促进抗体产生[16]，两类细胞的平衡在自身免疫性疾病中发挥重要作用[17]。IL-4具有多种免疫功能，包括辅助Th细胞进行分化、先天免疫应答的过程，且促进活化的T细胞生长[18]。在本试验中，试验组与对照组相比，IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ含量都有不同程度的升高，试验前期蝉花多糖组IL-4含量显著升高，试验后期蝉花菌丝体组IL-4含量呈显著升高。表明蝉花多糖和蝉花菌丝体多糖可能通过诱导机体免疫细胞产生IL-4等细胞因子，从而增强体液免疫功能。研究发现，随着IL-4细胞因子含量的升高，同期H5-Re8、H7N9抗体水平比对照组相应提高，表明蝉花多糖能激发Th2类细胞提高体液免疫水平。Huang等[19]研究发现，灵芝多糖和猪苓多糖能显著增强小鼠机体内巨噬细胞的吞噬功能和NK细胞的活性。

早期试验多糖用于鸡生产,有助于促进生长、提升血清中干扰素等分泌水平等积极增强免疫的作用[20]。TNF-α、IFN-γ等细胞因子参与细胞免疫[21-22]；滕丽花等[23]证实，多种中草药多糖(黄芪、鱼腥草等)都能刺激细胞因子产生，提高机体巨噬细胞的吞噬作用，从而增强机体免疫力，发挥中草药多糖抗感染等作用。本试验研究结果表明，蝉花多糖组和蝉花菌丝体组TNF-α含量有显著升高。

3.3 蝉花多糖对三黄鸡免疫相关基因表达量的影响

脾脏类属外周免疫器官，是机体免疫应答的主要场所之一,鸡脾脏基因表达分子水平一定程度上反应鸡免疫调节机理。IFN-γ具有激活且促进巨噬细胞功能、激活中性粒细胞功能等作用[24]。本试验结果显示，蝉花菌丝体组脾脏IFN-γ、IL-4基因含量高于对照组。这与敖艳华等[25]的试验结果相似，提示IFN-γ的升高能增强机体的体液免疫，禽流感免疫后抗体水平维持更久。多糖能促进淋巴细胞分泌IFN-α、IL-2等多种与免疫相关的因子产生，可能与IFN-γ发挥着较强的免疫调节功能相关，能增强H5亚型鸡禽流感疫苗的免疫作用，从而保护机体的免疫系统[26]。

4 结论

在三黄鸡雏鸡阶段饲喂蝉花多糖或蝉花菌丝体能提高鸡禽流感疫苗抗体水平，可作为增强免疫型添加剂进一步开发利用。虽然蝉花多糖的生产成本是蝉花菌丝体的7倍，但蝉花菌丝体剂量是蝉花多糖的40倍，结合药物剂量和生产成本，蝉花多糖推广应用价值更高。