26种圈养珍稀鸟类性别的快速分子生物学鉴定

朱向蕾

(上海动物园，上海 200335)

性别是鸟类最重要的特征之一，鸟类的雌雄个体在生理、行为、生态等方面具有差别。鸟类的性别鉴定，特别是性别的早期鉴定对鸟类的饲养管理、繁殖与育种、遗传疾病的防治、进化生态学、种群结构和群体遗传分析等方面都有非常重要的意义，尤其是对濒危珍稀鸟类的保护研究和管理具有重要作用[1-4]。为了保护生态平衡，许多动物园通过人工饲养繁育的方法来提高濒危鸟类的存活率和繁殖率，而动物的繁殖育种均离不开性别鉴定，合理的性别比例是动物得以繁殖的必备条件之一。

全世界鸟类中有超50%的鸟类是雌雄同形的单态性鸟类，这些鸟类无论成幼均很难从外观形态上来鉴别性别[5]。对单态性成鸟或雏鸟/亚成鸟的常规鉴定方法有：生殖器官形态学检视、生理激素测定等，对鸟类均造成一定的应激或侵入式伤害，尤其是雏鸟、珍稀个体。因此，使用快速可靠安全的方法鉴别性别，对鸟类保育研究工作的成功开展尤为重要。

鸟类性别鉴定有很多方法，可以从身体表面的明显斑块、个体的行为观察、形态学特征的差异、解剖学或腹腔镜检查以及性染色体的检查等方面进行。传统的性别鉴定方法有腹腔镜检查、翻肛鉴别、类固醇鉴别、核型分析等[6]。腹腔镜检查需要麻醉，有一定风险，对于濒危野生动物并不适宜；翻肛鉴别需要相当丰富的经验；利用排泄物进行类固醇鉴别耗时，准确性低；核型分析获得结果时间较长，对于Z染色体和W染色体差异较小的鸟类不适用。随着时代的进展，分子生物学飞速发展，性染色体的鉴定检查趋于流行，染色体螺旋蛋白(CHD)基因属于功能性基因，十分保守，有2个同源拷贝CHD-W和CHD-Z，在鸟类性别鉴定中发挥着巨大作用[7]。

上海动物园目前饲养有鸟类19目42科180余种，超过70%的种类为单态性鸟类，近90%的个体性别信息尚不明确。自上世纪70年代起，该园一直开展珍稀鸟类的人工饲养繁育工作。胡瑞颖等[8]已经对丹顶鹤、白枕鹤、东方白鹤等9种86只国家一级保护鸟类进行了性别鉴定，田秀华等[9]对7种鹤形目鸟类进行了性别鉴定，相关成果运用于繁育实践，为在更广范围内进一步开展鸟类性别的分子鉴定工作奠定了基础。

本研究主要通过分子生物学手段在已有研究的基础上对鸟类的性别进行快速准确地鉴定，以便为动物园中鸟类群体的饲养管理和繁殖育种提供性别信息。

1 材料与方法

1.1 样品采集

采集上海动物园内正常饲养的部分鸟类羽毛，包括斑嘴环企鹅、鹈鹕、鹤鸵、小天鹅、鞭笞鵎鵼、鹤鹳类、鹦鹉类等共涉及9目26种258只。采集样品均为鸟类胸部体毛，确保羽根完整，常温干燥保存，或-80 ℃长期保存。使用含EDTA抗凝管采集鸟翅根处血液，-20 ℃冷冻保存待用。

1.2 主要试剂

使用MiniBEST Whole Blood Genomic DNA Extraction Kit(Code No.9781)提取血液样本组DNA，-20 ℃冷冻保存待用。MightyAmpTMDNA Polymerase Ver.3 Kit、HaeⅢ、6×Loading Buffer、50 bp DNA Ladder均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 引物设计

参考文献[10-11]设计引物，3对引物序列如下：P2(5′-TCTGCATCGCTAAATCCTTT-3′)、P8(5′-CTCCCAAGGATGAGRAAYTG-3′)；2550 F(5′-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3′) 、 2718R (5′-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3′)[10]；K7(5′-AGGGTGTCTAGAACAAAAGAGA-3′)、W1(5′-CCTTTAAACAAGCTGTTAAAGCA-3′)[11]，引物由英潍捷基公司合成。

1.4 PCR反应与酶切反应

PCR反应体系为20 μL，其中：MightyAmp DNA Polymerase 0.4 μL，2×MightyAmp Buffer 10 μL，引物各0.6 μL，其中血液样本DNA 2 μL或剪取1 mm长2～3段羽根，补充ddH2O至20 μL。P2/P8、2550F/2718R退火温度为48 ℃，K7/W1采用55 ℃、50 ℃、47 ℃温度降落式PCR，反应在PCR仪上进行。1.5%～2.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，产物由宝生物工程(大连)有限公司进行克隆测序。酶切体系为：HaeⅢ 0.5 μL，10×M Buffer 1 μL，PCR产物8.5 μL。37 ℃水浴过夜(16～20 h)[12]。酶切后产物经1.5%～2.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果

2.1 羽根样品及PCR方法的有效性验证

以已知性别的火烈鸟和美洲红鹮为例，分别以血液抽屉的DNA和羽根样本作为模板，2550F/2718R为引物，扩增CHD基因片段，验证以羽根样品直接PCR检测的有效性和可靠性。

产物经凝胶电泳，结果显示2种鸟类的雄性均扩增出1条条带，经克隆测序与NCBI GenBank序列比对，大小为663 bp；雌性均扩增出2条条带，大小分别为663 和460 bp。两物种血液组DNA与羽根样本扩增结果一致，性别鉴定结果准确。从图1观察，以未经提取纯化的羽根为模板的PCR产物，条带清晰度和产物浓度与血液组DNA相比，无明显差异，也无明显非特异性扩增，可用于性别鉴定(图1)。

1、5. 火烈鸟羽毛毛囊；2、6. 美洲红鹮羽毛毛囊；3、7. 火烈鸟全血基因组DNA；4、8. 美洲红鹮全血基因组DNA；M. Marker

2.2 白鹈鹕和斑嘴环企鹅的性别鉴定

利用P2/P8引物对白鹈鹕进行性别鉴定，鉴定结果如图2所示。HaeⅢ酶切后雄性可出现1条条带，经克隆测序与NCBI GenBank序列比对，大小为321 bp;雌性为2条条带，大小分别为321和234 bp(图2)。

利用P2/P8引物对斑嘴环企鹅进行性别鉴定，单纯进行PCR扩增后，每个样品均扩增出1条条带，经克隆测序与NCBI GenBank序列比对，大小367 bp，难以判断性别。经HaeⅢ酶切后雄性可看到2条条带，其中明显的一条为302 bp，最下面1条条带较淡，未测序，大小在50～100 bp;雌性为3条条带，多了1条大小为367 bp的条带(图3)。

1、3、5、7、9. P2/P8引物扩增；2、4、6、8、10. 扩增产物经HaeⅢ酶切；M.Marker

1、3、5、7、9. P2/P8引物扩增；2、4、6、8、10.扩增产物经HaeⅢ酶切；M.Marker

2.3 鹤鸵的性别鉴定

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后结果如图4，所有样品均扩增出1条大小约350 bp的条带，而雌性除了350 bp大小的条带外，多扩增1条约150 bp的条带。

1～4. 用K7/W1引物扩增；M.Marker

2.4 检验样品及引物汇总

通过PCR方法对上海动物园中9目26种258只鸟类进行了性别鉴定，其中：鹦形目、鹳形目、鹤形目及鴷形目鸟类应用2550F/2718R引物，企鹅目及鹈鹕目应用P2/P8引物，鸵形目及鹤鸵目的非平胸类鸟类应用K7/W1引物，雁形目鸟类的引物选择根据种属的不同选择了不同的引物。试验过程中检验样品及引物汇总见表1。

表1 珍稀鸟类性别鉴定物种及其引物汇总

3 讨论

有研究尝试应用鸟类外部形态进行性别鉴定，如体重和尾长[15]、羽毛和大小[16]、性别特定行为和鸟喙长度[17]。与传统方法相比，分子生物学手段鉴定鸟类性别取样量小、准确率高、迅速、鸟类应激反应小，是开展鸟类饲养繁育、生态学、形态学等领域研究的基础技术。随着分子生物学的发展，利用DNA进行性别鉴定被广泛应用，血液和羽毛均可作为样本来源进行鉴定，为了减少对鸟类的损伤，采集羽毛可以降低鸟类的应激反应，避免了过度失血。动物园饲养的鸟类大多属于群养，如果有足够的笼舍可进行完善的隔离，非损伤性取样将会是最佳的取样方式。采集羽毛简便易行且对研究对象几乎无伤害，使其在对鸟类性别的分子生物学鉴定和保护遗传学研究领域中得到广泛的应用[18-19]。

3.1 火烈鸟

李文斌等[20]运用2550F/2718R这对引物对火烈鸟进行了性别鉴定，目的条带分别为800 bp和600 bp左右；陈蓉等[14]也应用这对引物进行了火烈鸟的性别鉴定，目的条带大小分别在750～500 bp，500～250 bp；本文的目的条带经测序后是663 bp和460 bp，与陈蓉等[14]的结果一致，但与李文斌等[20]结果略有差异，可能与退火温度有关，但并不影响结果判定。

3.2 企鹅

Zhang等[21]对帝王企鹅(Aptenodytespatagonicus)，凤冠企鹅(Eudypteschrysocome)，金头企鹅(Pygoscelispapua)和麦哲伦企鹅(Spheniscusmagellanicus)4种企鹅应用(2550F/2718R和P2/P8)2对引物进行了性别鉴定，结果2对引物并不适用于所有的企鹅。沈玮等[22]应用P2/P8引物对南京海底世界的6只帝企鹅进行了性别鉴定，但是由于CHD-Z和CHD-W的大小相近，琼脂糖凝胶电泳均显现出1条条带，给性别鉴定带来了一定困难。Costantini等[12]应用P2/P8引物对洪堡企鹅(Spheniscushumboldti)进行了性别鉴定，3项研究中都没有涉及到斑嘴环企鹅。本研究在洪堡企鹅研究的基础上应用P2/P8引物进行扩增，扩增后均显示1条条带，原因在于雌雄条带相差较小，难以区分。考虑到企鹅种间的相近性后续依旧用HaeⅢ进行了酶切，酶切后雌性可出现3条条带(367、 302 和 50～100 bp)，不同于洪堡企鹅(380、310和60 bp)；雄性表现为2条条带(302 和50～100 bp)，不同于洪堡企鹅(310和60 bp)。条带大小不同显示了物种间的差异性，但可以准确地进行性别判定，经一定数量的酶切反应试验，以更好地进行性别的判定。袁梦[23]应用引物P2/P8对鹈鹕性别进行鉴定，经酶切结果为雄性个体扩增出1条条带，大小为550 bp，雌性个体为2条条带，大小分别为550和490 bp，与本文结果有差异。分析可能本研究所用样品为白鹈鹕，可能是鹈鹕种间差异，亦或是退火温度的影响，具体原因有待进一步研究。

3.3 鹤鸵

非平胸目鸟类的性别鉴定引物无法用于平胸目鸟类性别的鉴定，Bello等[24]利用随机扩增多态性DNA法(RAPD)进行鸵鸟的性别鉴定，付晶等[25]建立了鸸鹋性别鉴定的分子标记方法，Huynen等[11]采用RAPD进行性别特异性标记，利用引物K1、K2、K3、K4对鸸鹋、鸵鸟等平胸目鸟类进行性别鉴定，但有时无法扩增雄性基因片段；进一步设计了W1和K7引物，该引物雌雄大小差异较大，对鸵鸟、鸸鹋的性别分析更为准确，但没有涉及到鹤鸵。本研究在此基础上改变了部分反应条件，缩短了变性和退火时间，降低了延伸的温度，所得结果可以准确有效地判断鹤鸵的性别，鹤鸵目的条带大小与 Huynen等[11]研究结果相符，具体大小有待测序。

3.4 样本选择

Jensen等[2]利用全血、卵黄囊和羽毛基因组DNA对47种鸟类进行了性别鉴定，结果发现羽毛中DNA量少，且电泳结果中有非特异性条带混入。本次研究中直接采用羽毛毛囊作为模板，未经过DNA提取与纯化，减少了在 DNA提取过程中造成的损失，节约了时间和成本，提高了效率，且经过反复试验，与全血基因组提取的性别鉴定结果完全一致，这种简单、快速且非损伤性取样的性别鉴定检测方法，为以生物保护为基础的鸟类学研究提供了实用有效的选择。为了提高PCR反应的可重复性，减少交叉反应的风险，可在加样过程中增加羽根的数量，不同样本间做好采样工具的消毒清洁工作。

综上，本研究对动物园内部分珍稀鸟类采用分子生物学手段进行了性别鉴定，准确性高，样品大多采用非损伤性取样，不仅减少了对鸟类的应激，而且简化了操作流程，提高了工作效率，并在此基础上针对一些新物种进行了性别鉴定的检验，为鸟类性别鉴定积累了更多的数据。然而鸟类种类繁多，考虑到鸟类的珍稀及采样难易程度，本研究目前涉及到9目中26种鸟类，鸮形目、隼形目、佛法僧目等鸟类有待进一步研究。

致谢：本研究在采样及检测过程中得到了上海动物园兽医院桂剑峰院长，陈晓兰、陆旖旎等兽医，以及鸟类饲养队组黄康宁、张志浩等同事的大力支持，在此表示感谢。