常温机械灌注对大鼠心脏死亡器官捐献供肝微循环保护作用的研究

杨柳，曹欢，孙东，侯宾，林玲，宋红丽（.天津医科大学一中心临床学院，天津3009；.天津市第一中心医院器官移植科，天津市器官移植重点实验室，中国医学科学院移植医学重点实验室，国家卫生健康委员会危重病急救医学重点实验室，天津3009）

心脏死亡器官捐献（donation after circulatory death， DCD）供肝经历较长时间的热缺血和缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury， IRI），静态冷保存（static cold storage， SCS）下，肝脏能量代谢和线粒体功能易于受损，对SCS 相关的IRI 特别敏感，应该限制暴露于SCS［1］。常温机械灌注（normothermic machine perfusion， NMP）模仿体内正常的代谢状态，很大程度上改善了DCD 供肝质量，优于SCS［2-3］。肝脏微循环结构和功能的变化在很大程度上影响着肝脏的生理功能，微循环障碍是导致肝脏损伤的决定因素［4-5］，本研究致力于探索NMP 对DCD 供肝的微循环的影响，研究其发挥保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料：血管性血友病因子（von Willebrand factor， vWF）、血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1， VCAM-1）抗体购自美国圣克鲁斯公司；内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthetase，eNOS）抗体购自美国细胞信号技术公司；诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthetase，iNOS）、细胞间黏附分子（intercellular cell adhesion molecule-1， ICAM-1）抗体购自中国武汉三鹰公司；内皮素-1（endothelin-1，ET-1）抗体购自中国博奥森公司。选取6 ～ 8 周、200 ～ 220 g 雄性SD 大鼠（n ＝42）获取DCD 肝脏；实验动物由中国食品药品检定研究院提供，合格证号：SCXK（京）2017-0005。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠DCD 肝脏获取及肝脏NMP 系统建立：SD 大鼠麻醉后，腹部中央切口暴露肝脏，结扎左膈下静脉、右肾静脉、肾上腺静脉丛和肝动脉；游离门静脉并结扎幽门静脉及脾静脉，插入胆管支架。剪开膈肌夹闭胸主动脉、棉棒压迫心脏模拟心脏死亡过程；温盐水纱布覆盖腹腔30 min 后取下肝脏。本研究大鼠NMP 系统是单循环系统设备，主要包括离心泵，膜氧合器，器官室，加热器，压力、温度监测器等。灌注液为含20 % FBS 和1 % 双抗的DMEM/F12 （1：1）培养液60 ml，并添加20 ml 新鲜血液、肝素、胰岛素和地塞米松。

1.2.2 实验分组和处理：实验分为3 组（n ＝42）：Normal 组（n ＝6），SCS 组（n ＝6），NMP 组（n ＝30）。 NMP 组，灌注后0、2、4、6 和8 h 收集流入道、流出道灌注液待检，并收集肝脏标本；SCS 组肝脏以 20 ml 4 ℃ UW 液（the University of Wisconsin solution）冲出肝内血液，并于UW 液中4 ℃ SCS6 h 后收集肝脏标本；Normal 组大鼠留取血清及肝脏待用。肝脏标本随机留取肝脏组织福尔马林固定，2.5 %戊二醛溶液固定，部分肝脏剪碎后液氮速冷，所有标本置于-80℃冻存待检。

1.2.3 肝功能及乳酸检测：检测流出道灌注液白蛋白（albumin， ALB）、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）的水平；血气分析检测流入道灌注液乳酸水平。

1.2.4 肝脏病理苏木精-伊红（hematoxylin and eosin， HE）染色：随机取各组肝脏组织，4 %甲醛溶液固定，制成石蜡切片进行HE 染色，显微镜镜下观察肝组织病理学改变；根据Suzuki 的标准进行分级评分［6］，具体评分标准见（表1）。

表1 Suzuki’s 评分标准

1.2.5 细胞凋亡检测（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling， TUNEL）：石 蜡切片经烤片、二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，蛋白酶K 通透、TUNEL 试剂反应，观察肝脏细胞凋亡情况。

1.2.6 透射电镜检测：随机取新鲜肝组织，切成2 mm×3 mm 的样品，2.5 %戊二醛溶液固定， 包埋、超薄切片后在透射电子显微镜下观察肝组织的超微结构。

1.2.7 Western blot：提取肝脏总蛋白并测定蛋白浓度，经行电泳、转膜，标记ET-1（1 ∶500）、eNOS（1 ∶500）、iNOS（1 ∶500）、ICAM-1（1 ∶500）、VCAM-1（1 ∶100）、vWF（1 ∶500）和GAPDH（1 ∶3000）。

1.2.8 统计学方法：采用SPSS 17.0 进行统计分析，全部数据均为计量资料，正态分布的数据处理均以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用q 检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠NMP 系统评价

2.1.1 大鼠NMP 系统对DCD 供肝肝功能、乳酸及胆汁分泌量的影响：各时间点ALB 水平无显著差异；ALT 和AST 表现为升高趋势，4 h 和6 h 的ALT、AST 水平无显著差异，其余各时间点之间水平差异显著，灌注6 h 以后，ALT 和AST 升高幅度显著，差异显著（P ＜0.05）；ALP 水平逐渐下降，各时间点水平无显著差异。灌注0 h 乳酸迅速下降至低水平，灌注6 h 以后，乳酸出现升高趋势，2 h 和6 h 乳酸水平差异显著（P ＜0.05）；胆汁分泌量水平逐渐增高，灌注6 h 以后胆汁分泌幅度减小（图1）。

图1 大鼠NMP 系统对DCD 供肝肝功能、乳酸及胆汁分泌量的影响

2.1.2 大鼠NMP 系统对肝脏组织病理学的影响：随灌注时间的延长，肝细胞空泡变性、水肿及肝窦淤血逐渐减轻，6 h（2.80±0.84）h 肝脏无明显病理损伤，灌注8 h（5.80±0.45）h 的肝脏病理表现恶化；灌注4 h（3.40±0.55）h 和6 h 的肝脏Suzuki 评分较低，无显著差异，肝脏病理表现最佳，提示随着灌注时间的延长IRI 逐渐得到改善，但灌注6 h 以后出现肝脏损伤（图2）。

图2 大鼠NMP 系统对DCD 供肝病理的影响

该大鼠NMP 系统可显著改善DCD 供肝的肝功能和肝脏组织病理学，但是灌注6 h 时供肝质量下降，提示该大鼠NMP 系统保存DCD 供肝的最佳、最长时间为6 h，进一步灌注可能影响供肝质量。

2.2 NMP 改善DCD 肝脏组织病理学：SCS 组肝细胞空泡变性、水肿及肝窦淤血较重、NMP 组肝细胞几乎无空泡变性、无肝细胞水肿及肝窦淤血。NMP（3.40±0.55）组Suzuki 损伤评分显著低于SCS（7.00±0.71） 组（F ＝229.75，P ＜0.05），提示NMP 保存DCD 供肝可改善供肝病理（图3）。2.3 NMP 减 轻DCD 肝 脏 细 胞 凋 亡：Normal（3.20±1.10）组凋亡小体最少，SCS（33.40±4.39）组凋亡小体最多，NMP（9.80±1.48）组凋亡显著低于SCS 组（F ＝166.58，P ＜0.05），提示NMP可减轻DCD供肝细胞凋亡，优于单SCS方式 （图3）。

图3 不同保存方式对DCD 供肝质量的影响

2.4 NMP 减轻DCD 肝脏细胞线粒体损伤：SCS 组肝细胞线粒体严重水肿、空泡变性，线粒体嵴结构紊乱、大部分消失，线粒体不可逆损伤严重（2.80±0.45），部分线粒体坏死溶解；NMP 组肝细胞线粒体几乎无肿胀、空泡变性，线粒体嵴结构完整，线粒体不可逆损伤较少（1.60±0.55，F ＝36.29，P ＜0.05）。提示NMP 可改善线粒体损伤（图4）。

图4 各组DCD 供肝组织超微结构的变化（×25 000）

2.5 NMP 改善DCD 肝脏微循环

2.5.1 NMP 抑制细胞间黏附和改善内皮细胞损伤：ICAM-1 和VCAM-1 是细胞间黏附分子，是炎症反应的产物，提示肝窦阻塞程度。NMP 组肝内ICAM-1（F ＝1728.45，P ＜0.05）和VCAM-1的表达显著低于SCS 组（F ＝254.72，P ＜0.05），提示：NMP 保存可减轻肝窦阻塞（图5）。NMP 组肝内vWF（F ＝595.30，P ＜0.05）的表达量显著低于SCS 组（P ＜0.05）。提示NMP 保存方式可减少肝脏内皮损伤（图5）。

图5 各组DCD 供肝黏附分子和vWF 的表达情况

2.5.2 NMP 改善ET-1/NOS 平衡和微循环灌注：肝内ET-1 表达于肝内血管及肝窦，NMP 组ET-1 的表达水平显著低于SCS 组 （F ＝1372.51，P ＜0.05）。提示NMP 抑制了肝内分泌ET-1 的作用，减少肝窦收缩，改善肝窦血流灌注（图6）。

图6 各组DCD 供肝ET-1/NOS 表达情况

肝内eNOS 表达于肝窦内皮和血管内皮，可产生NO，是内皮舒张因子，具有扩张血管和肝窦的作用。NMP 组肝内eNOS 表达水平显著高于SCS 组（F ＝271.66，P ＜0.05）。 肝 内iNOS表达于肝窦，由应激和炎症诱导产生，提示巨噬细胞活化程度。NMP 组肝内iNOS 表达量显著低于SCS 组（F ＝1102.20，P ＜0.05）。提 示NMP促进了DCD 肝脏合成eNOS，抑制iNOS 的生成（图6）。

3 讨 论

在该项研究中，我们采用稳定的单循环NMP系统，灌注时间选择0、2、4、6 h 和8 h，检测了肝功能、乳酸和胆汁分泌量指标，发现随着灌注时间的延长，灌注6 h 以后ALT 和AST 出现了明显的升高，乳酸水平在灌注6 h 后出现明显反跳升高，同时胆汁的分泌量升高幅度降低。组织病理学方面的表现，灌注后肝脏缺血/再灌注（ischemia reperfusion，IRI）逐渐得到改善，4 h 和6 h 的病理表现最佳，与肝功能表现一致的是，灌注6 h 以后出现了肝细胞水肿、肝窦淤滞等病理恶化的表现。为了研究效果的稳定性，综合评价该NMP 系统对供肝质量的影响，我们选择了NMP系统保存后供肝质量最佳的6 h 的肝脏进行后续的研究。我们评估了NMP 保存方式和SCS 保存方式对DCD 供肝质量的影响，发现保存DCD 供肝6 h，NMP 显著改善肝功能、肝脏病理和IRI，减少肝细胞凋亡，NMP 明显优于SCS；进一步发现NMP 对肝脏线粒体也具有保护作用。线粒体对缺氧和氧化应激非常敏感，与肝脏微循环的关系密切［7］。

缩血管因素ET-1 和扩血管因素NOS 两者之间的平衡对肝脏微循环稳态的维持具有重要作用。ET-1 是目前发现的最强的内源性缩血管肽，缺血、缺氧是ET-1 表达上调的重要刺激因素［8］。肝脏受损时，内皮细胞表达ET-1 增加，NO 产生减少，使得血管收缩、肝窦淤滞［9-10］。NOS 合成NO，主要是eNOS 和iNOS，eNOS 具有 改 善IRI作用，而iNOS 主要在炎症刺激下诱导产生，过度表达可促进ONOO-的产生，导致内皮功能障碍，促进IRI 的发生［11-13］。我们的检测结果发现NMP 保存方式抑制了DCD 供肝肝内ET-1 和iNOS的过度合成，促进了eNOS 的合成增加，NMP 对肝内ET-1 和NOS 的表达产生了显著的调节作用，NMP 对ET-1/NOS 平衡的调节可能与其持续灌注、供氧，改善肝窦淤滞有关，因此我们认为NMP 的保存方式可改善DCD 供肝微循环灌注，优于SCS。

研究表明，持续的NMP 可以建立保护级联，改善缺血缺氧造成的氧化应激损伤，ROS 释放发生限制到最低，减轻组织炎症［14-15］。ICAM-1 和VCAM-1 是炎症反应的产物，是细胞间黏附和浸润的标志，提示肝窦阻塞程度［16-17］，也是内皮功能障碍的特征性分子［18］。我们的研究发现NMP的保存方式显著抑制DCD 供肝肝内ICAM-1 和VCAM-1 的表达，优于SCS，提示了NMP 可通过持续灌注、供氧及提供代谢物质来减轻肝窦阻塞，减少肝窦内皮和血管内皮损伤。von Willebrand 是内皮损伤的标志，肝内vWF 水平的升高的程度提示内皮损伤程度和肝窦阻塞程度［19］，检测发现了NMP 的保存方式可以显著抑制DCD 肝脏vWF 的表达，内皮细胞损伤程度和肝窦阻塞程度最低，进一步验证了NMP 在改善DCD 供肝肝窦微循环障碍和内皮损伤的作用。

本研究表明，NMP 通过抑制DCD 供肝内细胞间黏附，改善肝窦阻塞和内皮损伤，调节肝内ET-1/NOS 平衡改善肝脏灌注进而改善DCD 供肝微循环来发挥保护作用。本研究中的NMP 系统是单循环系统，灌注系统没有设立排泄装置，灌注时间过长限制了灌注体系的器官修复水平，下一步我们将进一步改良灌注方法，做进一步的研究。