CARM1、p16INK4a 在子宫颈鳞状细胞癌中的表达及临床意义

刘丹丹 隋红梅 李爱华

组蛋白精氨酸甲基转移酶1 （coactivatorassociated arginine methyltransferase 1，CARM1）是蛋白质精氨酸甲基转移酶家族（protein arginine Nmethyltransferases，PRMTs）的成员之一，通过甲基化组蛋白和非组蛋白参与翻译后修饰，在信号转导、mRNA 剪接、转录调控、DNA 修复等方面发挥重要作用。新近研究表明CARM1 在多种人类癌症发生中有促进作用，如乳腺癌［1］、前列腺癌［2］、结肠癌［3］，但在子宫颈癌中未见报道。p16INK4a 是重要的抑癌因子，它通过抑制Rb 蛋白磷酸化来阻碍细胞周期蛋白的活化，使细胞周期发生停滞，从而发挥抑癌作用，有研究证实p16INK4a 蛋白精氨酸残基在肿瘤发生发展中发挥重要作用［4］，本研究旨在检测子宫颈鳞状细胞癌组织中CARM1 和p16INK4a的表达，分析两者与临床病理特征的相关性，以及与生存的关系，探讨两者是否存在交互作用，研究子宫颈癌可能的发病机制，为子宫颈癌的精准靶向治疗提供新思路。

资料与方法

一、病例选择

收集2010 年1 月至2012 年12 月期间聊城市人民医院病理科储存的子宫颈蜡块组织，选择具有完整临床病理信息的组织标本146 例。其中包括84 例原发性子宫颈鳞状细胞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC） 标本，患者中位年龄47.3 岁（27 岁～69 岁），均接受广泛性子宫切除术+盆腔淋巴结清扫±腹主动脉旁淋巴清扫术，排除6 例行新辅助化疗后手术的患者，以及16例晚期直接行放射治疗的患者，其他患者术前均未接受放、化疗、抗血管生成药物或免疫治疗等其他辅助治疗，分期参照国际妇产科协会（Federation International of Gynecology and Obstetrics， FIGO） 2018 年 分 期 标准：Ⅰ期28 例，Ⅱ期40 例，Ⅲ期16 例；病理分级：高分化36 例，中、低分化48 例。另外还收集了30 例宫颈上皮内病变组织［10 例低级别鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL）、20 例高级别鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL）］，10 例因子宫肌瘤切除子宫患者的正常子宫颈组织标本作为对照，CSCC 患者中位随访9.1 年，其中6 例因联系方式变更失访。本研究通过医院伦理委员会批准。

二、主要试剂和方法

CARM1 兔多克隆抗体（55246-1-AP）、P16 抗体试剂（ZM-0210）、兔二步法试剂盒（PV-6001）、DAB显色试剂盒（ALI-9018）、免疫组化抗原修复缓冲液（ZLI-9065）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，试验步骤参照兔二步法试剂盒（PV-6001）说明书。

三、免疫组化结果分析判定

由2 名有资质的病理科医师在光学显微镜下观察染色结果，并进行双盲判读，使用半定量评分法评估组织染色强度及染色细胞数百分比。根据染色强度计分：0 分（无色）、1 分（浅黄或黄色）、2 分（棕黄或褐色）、3分（深褐色）；根据染色细胞百分比计分：0 分（0%～5%）、1 分（6%～25%）、2 分（26%～50%）、3 分（51%～75%）、4 分（76%～100%）。总分是二者得分的乘积，如果小于3 分则为阴性，如果大于或等于3分为阳性。

四、统计学分析

使用统计软件SPSS 23.0 对实验结果进行统计分析。应用t检验进行组间比较，对于计数资料则用卡方或连续校正卡方检验，相关分析则使用Spearman 秩相关检验，单因素生存分析采用Kaplan-Meier 法进行分析，若P＜0.05 则认为差异有统计学意义。

结 果

一、CARM1 在CSCC 组织中的表达及与临床病理特征的相关性

1.CARM1 在宫颈鳞状上皮内病变及CSCC 组织中的表达情况

CARM1 在细胞核或细胞浆内表达，呈现棕黄色颗粒（图1），阳性表达率在正常子宫颈组织、LSIL、HSIL、CSCC 组织中呈递增趋势，CSCC 组CARM1 阳性表达率明显高于正常对照，与HSIL 相比差异无统计学意义，见表1。

图1 不同宫颈组织CARM1 IHC染色对比

表1 CARM1蛋白在正常宫颈组织、LSIL、HSIL、CSCC中的表达状况

2.CSCC 组织中CARM1 蛋白表达与临床病理参数的关系

CARM1 蛋白在CSCC 组织中阳性表达率为70.24%，与组织分化程度和浸润深度有关，与年龄和FIGO分期无关，见表2。

表2 CARM1蛋白阳性表达与CSCC患者临床病理特征的关系

二、p16INK4a 蛋白在CSCC 组织中的表达与临床病理特征的相关性

1.p16INK4a 蛋白在宫颈鳞状上皮内病变及CSCC组织中的表达情况

图2 不同宫颈组织 p16INK4a IHC染色对比

p16INK4a蛋白在细胞核或细胞浆表达，呈棕黄色颗粒（图2），阳性表达率在正常宫颈组织、LSIL、HSIL、CSCC 组织中呈递增趋势，其阳性表达率在CSCC 组织中高于正常对照及LSIL，与HSIL相比差异无统计学意义，见表3。

表3 p16INK4a在蛋白在正常宫颈组织、LSIL、HSIL、CSCC中的表达状况

2.CSCC 组织中p16INK4a 蛋白表达与临床病理参数的关系

p16INK4a 蛋白在CSCC 组织中高表达，其阳性表达率为92.86%，中低分化组高于高分化组，与年龄、FIGO分期及浸润深度无关，见表4。

表4 p16INK4a蛋白阳性表达与CSCC患者临床病理特征的关系

三、CARM1 和p16INK4a 在CSCC 组织中表达的相关性分析

Spearman 相关分析显示CSCC 组织中CARM1 和p16INK4a 蛋白表达呈弱正相关，r= 0.325，见表5）。

四、CARM1、p16INK4a 蛋白表达情况与CSCC生存预后的关系

采用Kalplan-Meier 方法分析：CSCC 患者中位生存时间为（97.08±4.06）月，CARM1阳性表达者为（90.45±5.29）月，阴性者为（112.76±4.12）月，CARM1 阳性表达者预后较差（Log Rank：χ2=5.321，P=0.021）（图3）。p16INK4a 阳性表达者中位生存期为（90.45±5.29）月，阴性者为（112.83±6.542）月，p16INK4a 阳性表达者预后较差（Log Rank：χ2= 0.597，P= 0.440）。COX 比例风险模型分析显示仅临床分期为独立预后因素，见表6。

表5 CSCC组织中CARM1蛋白与p16INK4a蛋白表达的相关性

图3 CARM1蛋白表达与CSCC患者生存时间的相关性

表6 单因素及多因素生存分析

讨 论

CARM1 是蛋白质精氨酸甲基转移酶家族（PRMTs） 的重要成员，是多种基因特异性转录因子的分子开关，如P53、NF-kB、LEF1/TCF4和E2Fs等，参与细胞的多种进程，包括基因表达［5］、转录偶联、mRNA 加工［6］、调节蛋白质稳定性和组织发育［7］，新近研究表明CARM1在多种人类癌症发生中有促进作用，如乳腺癌［1］、结肠癌［3］、前列腺癌［2］、白血病［8］、骨肉瘤［9］等，CARM1 在子宫颈癌的研究未见报道。

本研究发现CARM1 蛋白在细胞核或细胞浆内表达，呈现棕黄色颗粒，阳性表达率在正常宫颈组织、LSIL、HSIL、CSCC 组织中呈递增趋势，CARM1 蛋白在CSCC 组织中过表达，与分化程度和浸润深度相关，KaPlan-Meier生存分析显示CARM1阳性表达者预后不良。表明CARM1 在CSCC 发生发展进程中可能发挥促进作用。

p16INK4a蛋白是肿瘤抑制因子和细胞周期负性调控因子，控制细胞周期G1/S 转化［10］。研究表明p16INK4a蛋白是多种肿瘤细胞周期调控的早期分子事件和重要环节。p16INK4a 在肺癌［11］、乳腺癌［1］、肝癌［12］、黑色素瘤［13］，食管瘤［14］等组织中表达下调，参与多种肿瘤的发生和进展［15］。然而Carozzi F等研究发现p16INK4a 蛋白在正常宫颈组织中阴性表达，随宫颈病变的进展表达呈上升趋势［16］，有学者认为p16INK4a 与人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV） 感染存在一定关系［17］。可见，p16INK4a参与子宫颈癌发生发展的机制与其他肿瘤不同，可能是鉴别宫颈病变的良好指标［18］。

本研究发现p16INK4a 蛋白在细胞核或细胞浆表达，呈棕黄色颗粒，其阳性表达率在正常宫颈组织、LSIL、HSIL、CSCC 组织中呈递增趋势，在CSCC 组织中高表达，与组织分化程度相关，单因素分析显示p16INK4a 阳性表达者预后差（Log Rank：χ2= 0.597，P= 0.440），但差异无统计学意义。其原因可能在于作为调控细胞周期的抑癌基因，p16INK4a 蛋白通过抑制视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，pRb）磷酸化，阻止细胞由G1期进入S期，从而抑制细胞增殖。而在子宫颈鳞癌组织中，pRb 被HPV E7 蛋白灭活，从而释放E2F，导致细胞顺利通过G1/S 关卡，导致细胞过度增殖，最终癌症发生。于此同时通过p16INK4a-CDK4/6-p Rb 通路负反馈参与调节，导致P16 蛋白表达增多［19］。Mulvany NJ等人提出p16INK4a蛋白表达增加，比HPV持续感染更有意义，其表达异常代表pRb 基因异常更加准确［20］。和既往研究一致，p16INK4a 蛋白在宫颈高级别病变及宫颈癌组织中过表达，可作为宫颈癌诊断的分子生物学指标之一，对于HSIL的临床监测和治疗具有指导意义［21］。

Spearman 相关分析发现CSCC 组织中CARM1 和p16INK4a 蛋白表达呈弱正相关，表明两者在CSCC进展中可能发挥部分协同作用。有研究通过免疫共沉淀试验证实PRMTs 可提高P16 蛋白甲基化水平［8］。在不同细胞系中p16INK4a 蛋白精氨酸22、131 和138 是主要的甲基化位点，下调p16INK4a 精氨酸甲基化水平可促进p16-CDK4 结合，而PRMTs过表达可阻断p16-CDK4 的结合，抵消了野生型p16INK4a 诱 导A549 细 胞G1 期 阻 滞［22］，p16INK4a精氨酸甲基化水平依赖精氨酸甲基转移酶家族的作用。

此次研究采用2018 修订的FIGO 分期系统进行研究，部分患者因“淋巴结转移”分期升级，通过Cox比例风险回归模型研究多因素对于CSCC患者生存的影响，证实仅分期是独立预后因素，也论证了新分期对于患者风险分层及预后评估的指导意义［23］。由于部分病例信息不全，没有纳入HPV分型研究，考虑临床上在宫颈高级别病变治疗及随访中基因甲基化检测的广阔前景，在这一领域可进一步扩大样本量，延长随访时间，深入探讨临床应用价值。

综上所述，CARM1、p16INK4a 在子宫颈鳞癌中均过表达，二者的异常表达可能参与了CSCC 的发生发展过程，具体作用机制有待于深入探讨。