Perlecan 蛋白及其降解酶在子痫前期小鼠肾小球中的表达变化

郭红霞 陈绍云 高冰心 钟梅

子痫前期（preeclampsia，PE）是妊娠期特有的多系统进展性疾病，其特点是妊娠20周后出现高血压和蛋白尿，严重影响孕产妇和围产儿的生命健康。目前子痫前期的病因和发病机制尚不清楚，多认为是一种多因素和多机制的疾病，由孕妇、胎儿和胎盘等多方面因素共同作用引起，缺乏有效的预防、治疗方法［1］。近年来子痫前期发病率继续上升，且呈现新的特点，靶器官功能受损早、程度严重，肾为受损伤最早的靶器官，肾小球滤过屏障损伤引起蛋白尿发生，继而肾功能出现相应改变［2］，孕期出现子痫前期的女性以后发生终末肾疾病的风险增加［3］。

Perlecan 是迄今发现的最大蛋白聚糖之一，是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG）的核心蛋白，由基因HSPG2编码。前期研究［4-5］中利用差异蛋白质组学技术平台对妊娠期高血压疾病孕妇和正常孕妇尿液进行分析，获得了妊娠期高血压疾病的尿液蛋白指纹图谱，并鉴定出了30 种差异蛋白质，Perlecan 是其中的蛋白之一，相对于正常妊娠组，该蛋白在子痫前期患者尿液中含量下降。为进一步明确Perlecan蛋白在子痫前期肾组织中的变化，本课题组构建了正常孕鼠和子痫前期样小鼠模型以检测该蛋白的表达变化，现报告如下。

材料与方法

一、动物来源

8～10 周龄C57 BL/6J 野生型雌雄小鼠，体重18～20 g，购于南方医科大学实验动物中心，实验前适应性喂养2 周。雌雄小鼠以2∶1 的比例同笼，每天观察雌性小鼠阴道堵塞情况，发现阴道堵塞的当天被定为妊娠的第1 天并将孕鼠隔离。亚硝基左旋精氨酸甲酯（L-NAME）购自Sigma 公司，胶体铁黏多糖染色试剂盒购自Solarbio 公司，主要蛋白免疫印迹抗体购自Abcam 公司，肝素酶活性检测试剂盒购自上海基尔顿生物科技有限公司。

二、建模与分组

将孕鼠随机分为两组，每组5 只。正常孕鼠为NP 组，从妊娠第13～20 天每日皮下注射生理盐水；子痫前期样小鼠为PP 组，从妊娠第13～16 天每日皮下注射L-NAME 50 mg/kg，妊娠第17～20 天每日皮下注射生理盐水。两组分别于妊娠第0 天、第15天和第21天测量动脉血压；收集妊娠第1天及第20 天24 小时尿液测尿蛋白浓度；妊娠第21 天测量血肌酐浓度（血Cr）、尿肌酐浓度（尿Cr）和尿素氮（BUN）含量，颈椎脱臼处死孕鼠立即剖宫，记录胎鼠数目并测定胎盘质量。

三、实验方法

1.分离肾小球

妊娠21天两组小鼠均采用水合氯醛溶液进行麻醉，75%酒精消毒皮肤，暴露剑突，剪开隔膜，左心室放血。随后，沿着腹中线剪开腹腔，游离并迅速取出动物双侧肾，置于4 ℃的D-Hank’s 溶液中。肾用D-Hank’s 溶液洗涤三次，去除包膜，分离肾皮质，用眼科剪将皮质剪成碎泥状，用玻璃注射器针芯轻轻研磨肾皮质，并不断用D-Hank’s 溶液冲洗。该冲洗液先用80目不锈钢筛网过滤，滤过的溶液再过150 目的不锈钢筛网过滤，最后过200 目筛网。滞留在200 目筛网上的即为肾小球初步分离物，反复冲洗筛网后，收集分离物制成悬液，静止10 min 后，1 000 r/min 离心5 min，弃除上清，收集纯化后的肾小球沉淀，加入含10%FBS 的DMEM 培养液制成肾小球悬液，即完成了肾小球的分离。

2.胶体铁染色法

根据改良Hale 胶体铁黏多糖染色试剂盒（Solarbio）操作说明，将所有分离出的肾小球脱水、固定、包埋、切片并脱蜡，将切片浸入弱酸溶液中5 min 进行预处理，然后在Hale stain 溶液中染色60 min，用弱酸溶液清洗3 ～4 次，每次2 min，然后将Perls stain 染色液滴在切片上染色10 min，将切片用蒸馏水洗涤3～4 次，滴加Perls 复染溶液在切片上染色5 min，用水洗涤后使用梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树脂密封，最后在电子显微镜下观察切片。

3.肝素酶（heparanase，Hpa）活性检测

用肝素酶标准品制备标准曲线，将酶促水解缓冲液（85 μL），肝素（5 μL）分别和动物水平两组肾组织匀浆（10 μL）依次添加到96 孔板中，并孵育3 h。每孔加入100 μL 四唑蓝显色液，在60 ℃恒温槽中孵育2 h。最后使用酶标仪（Bio-Tek Instruments）在570 nm下检测光密度值。

4.蛋白免疫印迹检测

根据参考文献［6］进行Western blot 分析，提取两组小鼠的肾小球总蛋白，利用蛋白免疫印迹检测Perlecan 及其降解酶Hpa 的表达水平，然后用ECL化学发光检测试剂盒（Millipore，Billerica，MA，USA）对膜进行可视化观察及扫描，并用Quantity-One软件进行定量分析。

表1 两组动物模型鉴定相关指标的比较（±s）

表1 两组动物模型鉴定相关指标的比较（±s）

组别NP组PP组t值P值妊娠第0天75.46±2.64 77.38±1.03 1.51 0.168 4血压（mmHg）妊娠第15天78.00±4.14 100.27±6.16 6.712 0.000 2妊娠第21天82.18±0.86 112.78±1.16 47.49＜0.000 1尿蛋白（mg/L）114.23±82.00 399.81±145.05 3.83 0.005 0胎鼠数目（个）12.60±0.55 9.00±0.71 9.00＜0.000 1胎盘质量（g）0.14±0.01 0.09±0.01 10.61＜0.000 1

四、统计学处理

采用SPSS 20.0 软件对所测数据进行统计学处理，计量资料用样本均数±标准差（x±s）表示，并使用Graph Pad Prism 7.0 软件（Graph-Pad Software，La Jolla，CA）进行分析。所有实验均重复3次。组间定性资料比较采用卡方检验；两组定量资料比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、模型鉴定

PP 组孕鼠皮下注射L-NAME 后，血压逐渐上升，与NP 组相比在妊娠第21 天血压出现显著性差异（P＜0.05）且血压升高30 mmHg 以上，说明建模成功［7］；PP 组给药建模后，尿蛋白明显增加，差异有显著性（P＜0.05）；胎鼠数目及胎盘重量明显下降（P＜0.05），见表1。进一步比较两组肾功能相关指标，发现PP 组血Cr、尿Cr、BUN 较NP 组明显升高［177.18±26.48）vs（74.64±25.80）μmol/L、（6 512.40±1 127.45）vs（2 590.03±1 082.69）μmol/L、（8.32±3.31）vs（3.98±1.74） mmol/L，P值 均＜0.05］，再次证实建模成功。

二、胶体铁染色结果

胶体铁染色通过胶体铁颗粒与组织中的酸性黏液结合形成不溶性复合物并显色，反映组织中所带负电荷情况，蓝色越深，黏液越酸，组织中的负电荷就越多。与NP 组比较，PP 组孕鼠肾小球电荷屏障被破坏，负电荷基本消失，见图1。

图1 两组孕鼠肾小球胶体铁染色结果

三、蛋白免疫印迹结果

从Western blot 分析结果均可以看出，Perlecan蛋白在PP 组子痫前期样孕鼠肾小球组织中表达较NP 组正常孕鼠显著降低（P＜0.05），而其降解酶Hpa 的表达则与之相反，PP 组子痫前期样小鼠中Hpa 含量显著高于NP 组正常孕鼠（P＜0.05），见图2。

图2 两组孕鼠肾小球Perlecan及降解酶Hpa蛋白表达

四、肝素酶（Hpa）活性检测结果

PP 组孕鼠肾小球肝素酶活性明显高于NP 组（P＜0.05），见图3。

讨 论

图3 动物水平两组孕鼠肾小球肝素酶活性检测结果

肾小球滤过膜由肾小球内皮细胞表层、内皮细胞、肾小球基膜（glomerular basement membrane，GBM）、足细胞和足细胞下间隙等五层结构组成，GBM 为凝胶状的细胞外基质，主要由Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、巢蛋白及蛋白聚糖构成，其中的蛋白聚糖主要以HSPG 为主，其蛋白核心包括Perlecan、焦聚蛋白等，是肾小球滤过的主要机械和电荷屏障，在肾小球滤过中起重要作用。Perlecan 蛋白可以被体内唯一一种HSPG 降解酶Hpa 降解，释放多种活性因子，产生一系列生物反应，行使不同的功能，从而具备生物功能的多样性［8］。研究［9］显示在不同肾病模型的肾组织上可以观察到HSPG 和Perlecan 水平的下降，其表达量与蛋白尿呈反比，发现其发生机制不仅与电荷屏障损伤有关，HSPG还可能通过介导细胞与基膜黏附、结合并转导生长因子信号等途径对肾造成损伤。Shen Q 等［10］通过对胎儿生长受限的大鼠肾进行蛋白质组学研究也发现，相对于正常对照组，胎儿生长受限大鼠肾Perlecan 显著下降，可能通过促进凋亡和抑制生长因子与细胞表面黏附在肾发生异常中起重要作用。

目前关于Perlecan 蛋白在子痫前期中的研究很少，Chui A 等［11］通过测定子痫前期和正常妊娠胎盘组织中蛋白多糖的表达情况，发现五种蛋白多糖包括Perlecan 的mRNA 在子痫前期的胎盘中表达显著下降，说明胎盘中蛋白多糖的表达不足也可能是子痫前期胎盘病变的特征之一。而子痫前期患者胎盘组织中Hpa 表达显著高于正常妊娠女性［12］，国内目前没有关于Perlecan 蛋白在子痫前期患者中的直接报道。

本研究通过构建子痫前期样小鼠模型，发现相对于正常妊娠小鼠，子痫前期样小鼠肾小球基底膜上Perlecan蛋白表达下降，与Raats CJ等［9］的研究结果一致，该研究也在肾病模型肾组织中也发现Perlecan 蛋白含量降低。本研究同时对肾小球基底膜的负电荷进行了检测，结果发现子痫前期样小鼠肾小球基底膜负电荷基本消失，电荷屏障确实被破坏，进一步说明子痫前期样小鼠肾小球结构可能损伤，从而引起肾小球滤过功能障碍出现蛋白尿。Hpa 在正常大鼠肾小球不表达，肾小管呈低表达，当肾处于病理状态下时Hpa 的表达增高，突出表现在肾小球Hpa 的表达变化。屈微等［13］通过动物实验发现，在妊娠期高血压疾病组中，Hpa 在肾小球中表达较正常妊娠组明显增强，本研究实验结果也证实Hpa 含量及活性均上升，可能是引起Perlecan 蛋白下降造成肾结构损伤的原因。

由此可见，子痫前期样小鼠模型肾Perlecan 蛋白表达下降，其唯一降解酶Hpa 升高且活性增强，引起肾小球基底膜负电荷减少，肾小球滤过屏障障碍，从而出现蛋白尿等子痫前期症状，是导致子痫前期肾损伤的机制之一。