白细胞介素-38对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化作用及机制研究

魏辉 李慧 余国华 董素娟 朱卫芳

1天门市第一人民医院（湖北天门431700）；2武汉科技大学职业危害识别与控制湖北省重点实验室（武汉430065）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种由脂质代谢紊乱和免疫反应失衡引起的动脉管壁的慢性炎症性疾病，是严重危害人类健康的主要致死或致残的疾病之一。AS 病理机制复杂，其中炎症与动脉粥样硬化的发生发展密切相关［1-2］。大量的免疫细胞、免疫介质参与动脉粥样硬化的发生过程。促炎细胞因子如IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）参与动脉粥样硬化斑块形成［3-4］。白细胞介素（interleukin，IL）-38 是IL-1 家族成员，与IL-1拮抗剂（IL-1 receptor antagonist，IL-1Ra）和IL-36Ra的氨基酸同源，能够与IL-36 受体特异性结合，诱导下游信号通道，达到抗炎作用［5-6］。YANG 等［7］研究表明，IL-38 能够有效抑制ox-LDL 诱导的内皮细胞炎症。高脂血症患者给予阿托伐他汀后导致了IL-38 水平升高，这表明IL-38 可能对高脂血症的治疗有一定保护作用。此外，在冠心病患者动脉粥样硬化的板块中发现IL-38 mRNA 表达。这些研究提示，IL-38 在心血管疾病中起着重要作用。目前，抗炎治疗已经成为防治动脉粥样硬化的一种新途径［8］。ApoE-/-小鼠的病理改变类似于人类Ⅱ型高脂血症，利用ApoE-/-小鼠建立AS 模型，能观察到粥样斑块发展的不同阶段，且与人类AS 病变特征十分相似。本研究旨在探讨外源重组IL-38 对小鼠AS 的影响及机制，为新型抗炎治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器具有C57BL/6遗传背景的ApoE-/-小鼠购买于北京华阜康，血浆胆固醇、三酰甘油检测试剂盒（南京建成），斑块染色（0.3%油红O 染色液），组化α-SAM、CD68、CD4、MMP-2 和MMP-9抗体（武汉塞维尔生物），流式抗体CD4-FITC、IFNγ-PE、IL-17a-PE、CD25-APC、Foxp3-PE、CD11-b-TITC、F4/80-APC、CD206-PE（eBioscience）、ELISA试剂盒IFN-γ、IL-17、IL-10 和TGF-β（锐博生物）小鼠IL-38 重组蛋白（Adipogen AG）。多功能酶标仪为Bio-tek 品牌，流式细胞分析仪属于BD LSRFortessa。

1.2 动物分组20 只雄性ApoE-/-小鼠，采用随机数字法分为对照组和rIL-38 组（n= 10）。每组小鼠给予西方饮食饲料（胆固醇0.15%）。对照组予以腹腔注射PBS，rIL-38 组予以腹腔注射外源重组IL-38（2.5 mg/kg），并于第9、12、15、18 周的第1 天开始干预，连续5 d为1周期，共干预4周期。

1.3 血清胆固醇、甘油三酯检测末次给药后，小鼠禁食12 h。腹腔注射10%水合氯醛（按小鼠体质量10 mL/kg）麻醉小鼠，经内眦静脉取血并收集于1.5 mL EP 管中，4 ℃离心15 min（3 500 r/min），分离血清，储存于-80 ℃冰箱。检测时按总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）检测试剂盒的标准操作说明书，检测血清中TC、TG 水平。

1.4 动脉粥样硬化斑块面积检测将主动脉固定于4%多聚甲醛组织固定液中，经过脱水、包埋、制片、油红O 染色，用显微镜观察主动脉的斑块脂质堆积情况。利用主动脉根部连续冰冻切片法（约7 μm），计算三个主动脉瓣环位置染色区域面积之和，从主动脉窦出现到主动脉窦消失的切片过程中，每隔50 μm 选取1 张切片做分析，总共计算五个切面，并用病理图像分析软件测量总形态病变面积（以μm2/切片为单位）。

1.5 斑块稳定性检测切片取材于油红染色的切面以下约7 μm 的连续组织切面，做α-SAM、CD68、CD4+T 细胞、MMP-2 和MMP-9 免疫组织化学染色和胶原纤维成份的Masson 染色。采用Image pro-Plus 6.0 分析计算阳性百分率。斑块稳定性=（α-SAM面积+胶原面积）/（巨噬细胞面积+油红面积）。

1.6 流式细胞仪检测Th1、Th2、Th17、Treg 和巨噬细胞比例取各组小鼠脾脏组织制作淋巴细胞悬液，依据流式细胞术操作说明书方法，分别检测CD4+IFNγ+细胞（Th1）、CD4+IL-4+细胞（Th2）、CD4+IL-17+细胞（Th17）和CD4+CD25+Foxp3+细胞（Treg）占CD4+T 细胞数比例和CD11b+F4/80+CD206+（M2）占CD11b+F4/80+（巨噬细胞）比例。

1.7 酶联免疫法检测小鼠血浆各细胞因子的水平麻醉小鼠后，经内眦静脉取血，用无菌管盛装，常温以1 500 rpm 离心10 min 后取血浆，保存于-80 ℃冰箱中。采用酶联免疫法（ELISA）测定IFN-γ、IL-17、IL-10 和TGF-β浓度。

1.8 统计学方法应用SPSS 22.0 进行统计分析，计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 rIL-38对小鼠动脉粥样硬化斑块的影响对两组小鼠进行油红O 染色计算斑块面积，与对照组相比，rIL-38 组使主动脉斑块面积减少达33.5%，差异 有统计学意义［（161.0 ± 35.53）vs.（242.1 ±43.28），P＜0.01）］，见图1。结果表明，外源rIL-38能显著减少动脉粥样硬化斑块面积。

图1 rIL-38 对ApoE-/-小鼠主动脉粥样硬化面积的影响Fig.1 Effects of rIL-38 on atherosclerotic lesion in ApoE-/-mice

2.2 rIL-38 对小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性的影响rIL-38 组斑块内胶原以及α-SAM 含量明显高于对照组［胶原纤维：（47.15 ± 7.06）%vs.（30.14 ±6.47）%，α-SAM：（22.53±5.01）%vs.（13.26±4.63）%，均P＜0.05］，CD68 和CD4+T 细胞含量明显少于对照组，提示泡沫化被抑制［CD68：（20.31 ± 5.59）%vs.（30.76±6.97）%，CD4+T细胞：（67.21±20.36）/mm-2vs.（109.10±22.45）/mm-2，均P＜0.05］。与对照组相比，rIL-38 组主动脉窦基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9 含量也明显减少［MMP-2：（9.46 ± 3.52）%vs.（23.13 ± 3.57）%，MMP-9：（15.36 ± 4.64）%vs.（28.77±8.16）%，均P＜0.05）］，见图2。

图2 rIL-38 对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性的影响Fig.2 Effects of rIL-38 on Stability of atherosclerotic plaques in ApoE-/-mice

2.3 rIL-38 对小鼠体质量、血脂的影响两组小鼠体质量、TC 和TG 水平差异均无统计学意义，见表1。

表1 两组小鼠体质量、TC 及TG 的水平Tab.1 The levels of Weight，serum TC and TG in ApoE-/-mice ±s

表1 两组小鼠体质量、TC 及TG 的水平Tab.1 The levels of Weight，serum TC and TG in ApoE-/-mice ±s

注：与对照组比较，#P ＞0.05

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2.4 rIL-38 对脾脏免疫细胞的影响与对照组相比，rIL-38 组Th1、Th17 数量明显减少，Treg 数量明显升高［Th1：（15.64±1.31）%vs.（21.41±2.17）%，Th17：（0.73% ± 0.22）%vs.（2.26 ± 0.68）%，Treg：（11.54±1.31）%vs.（7.46±0.57）%，均P＜0.05）］，但Th2在两组中无统计学差异［Th2：（1.64 ±0.25）%vs.（1.59±0.27）%，P＞0.05）］，见图3。rIL-38 组M2 巨噬细胞比例明显升高［M2：57.37% ±2.92%vs.%36.92%±4.21，P＜0.05］，见图4。

2.5 rIL-38 对炎症因子的影响与对照组相比，rIL-38 组血浆IFN-γ、IL-17 水平明显减低，IL-10、TGF-β水平升高［IFN-γ：（227.7 ± 56.9）pg/mLvs.（425.5 ± 102.3）pg/mL，IL-17：（85.8 ± 47.1）pg/mLvs.（175.3±69.1）pg/mL，IL-10：（174.9±26.9）pg/mLvs.（72.5±36.8）pg/mL，TGF-β：（548.2±76.3）pg/mLvs.（309.3±82.4）pg/mL，均P＜0.05］，见图5。

3 讨论

IL-38 是新发现的IL-1 家族成员。IL-1 家族成员通过连接到炎症细胞表面的IL-1 受体，诱导下游AP1 和NF-kB 等信号，进而诱导环氧合酶（iCOX）、一氧化氮（iNOS）合成和其他炎症介质的表达。IL-38 与IL-36Ra 同源度较高，也可发挥与IL-36Ra 类似的受体拮抗活性，抑制IL-36（α、β或γ）与IL-36R 结合，从而发挥抗炎作用［5，9］。IL-38还可以影响巨噬细胞以及Th17 细胞的相关炎症因子（IL-17，IL-22，TNF-α等）的产生和分泌，从而在多种自身免疫性疾病［10-11］和心血管疾病［12-13］中发挥作用。本研究旨在探讨rIL-38 对小鼠动脉粥样硬化的影响，阐明其对斑块面积、斑块稳定性、脾脏免疫细胞和血浆炎症因子水平的作用。

图3 rIL-38 对ApoE-/-小鼠脾脏T 细胞的影响Fig.3 Effects of rIL-38 on T cells in spleen of ApoE-/-mice

图4 rIL-38 对ApoE-/-小鼠脾脏M2 巨噬细胞的影响Fig.4 Effects of rIL-38 on M2 macrophages in spleen of ApoE-/-mice

图5 rIL-38 对ApoE-/-小鼠炎症因子的影响Fig.5 Effects of rIL-38 on inflammatory factors in spleen of ApoE-/-mice

YANG 等［7］研究表明，高脂血症患者的IL-38 mRNA 和血清蛋白水平高于健康对照组。体外实验证实IL-38 能有效抑制外周血单个核细胞产生IL-6、IL-1β和CRP。在高脂血症小鼠模型中，IL-38的过表达也能显著抑制促炎因子的表达，减轻动脉粥样硬化病变的形成。本研究发现，rIL-38 组ApoE-/-小鼠AS 斑块面积显著减少，但血清中TC、TG 水平未明显下降，这表明rIL-38 对ApoE-/-小鼠AS 具有明显保护作用，其作用机制并非通过降脂作用而是通过其他潜在的分子机制实现的。

本研究发现rIL-38 组小鼠粥样斑块内胶原纤维和平滑肌细胞（α-SAM）含量明显增加，而巨噬细胞（CD68）和CD4+T 细胞显著减少，这表明斑块稳定性增加。据文献报道［14-15］，MMP2/MMP9 在AS 发病过程中发挥重要作用：可通过促进平滑肌迁移，降解细胞胶原及参与钙质沉着等方面，加速AS 进展。这种保护作用可能是通过抑制MMP2/MMP9来实现的。

Th 细胞是AS 斑块中的主要适应性效应细胞。T 淋巴细胞是最早进入AS 斑块的细胞之一。Th17/CD4+CD25+Foxp3+Treg 失衡已证实与AS 的发生、发展密切相关［16-17］。本研究表明，rIL-38 组小鼠脾脏Th1、Th17 数量明显下降，炎症因子IFN-γ、IL-17 水平显著降低。一方面，IL-38 可能通过与IL-36 受体特异性结合，从而抑制IL-17 的表达；另一方面，IL-38 与IL-1Ra 拮抗活性的剂量效应相似，可能通过抑制IL-22 表达，共同抑制炎症介质的产生，延缓AS 进程。MENG 等［14，18］发现ApoE-/-小鼠的AS 斑块中，调节性T 细胞（Treg）可以通过增加平滑肌细胞和胶原蛋白含量，减少促炎细胞因子的释放和MMPs 的产生，从而降低斑块破裂的风险。Treg 细胞通过介导细胞因子释放来促进M1巨噬细胞向M2巨噬细胞转化，通过其抗炎作用使斑块稳定性增加［19-20］。本研究结果显示，IL-38 能显著提高Treg数量，这可能与IL-38 能介导巨噬细胞向M2 型转化有关，从而起到延缓AS 的作用。然而，本研究尚未验证IL-38 在不同细胞系作用，其结果是否与动物试验相一致，仍需进一步证实。

综上所述，rIL-38 能有效抑制ApoE-/-小鼠的AS进程，减少了斑块处促炎巨噬细胞，促进了斑块的稳定性。这种保护作用可能是通过抑制Th17/CD4+CD25+Foxp3+失衡，减少炎症因子表达，促进巨噬细胞向M2 型转化来实现的。