六味安神中药对小鼠镇静催眠作用影响的研究*

河北中医学院药学院 河北省高校中药组方制剂应用技术研发中心

王婷婷 王 芮 杨伟丽 刘艳蕊 柴天川 王 茜(石家庄 050091)

提要 目的：研究酸枣仁、延胡索、百合、地黄、半夏、夏枯草6味安神中药对戊巴比妥钠阈下剂量小鼠的睡眠只数，阈上剂量小鼠的睡眠潜伏期和睡眠持续时间以及对对氯苯丙氨酸(PCPA)失眠小鼠脑神经递质含量的影响，探讨其镇静催眠的作用及机制。方法：168只昆明小鼠，随机分为7组：正常组、酸枣仁组(2.25 g/kg)、延胡索组(1.50 g/kg)、百合组(2.25 g/kg)、地黄组(2.25 g/kg)、半夏组(1.35 g/kg)、夏枯草组(2.25 g/kg)。连续灌胃给药10 d，通过阈下剂量戊巴比妥钠协同睡眠实验，观察各组小鼠睡眠只数；通过阈上剂量戊巴比妥钠协同睡眠实验，观察各组小鼠睡眠潜伏期及睡眠持续时间。96只昆明小鼠，随机分为8组：正常组、模型组、酸枣仁组、延胡索组、百合组、地黄组、半夏组、夏枯草组。采用腹腔注射PCPA法复制失眠小鼠模型，药物治疗14 d。运用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、五-羟色胺(5-HT)的含量，同法检测垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)和下丘脑促肾上腺皮质激素释放素(CRH)的含量。结果：与正常组比较，各给药组小鼠睡眠只数增加，睡眠潜伏期缩短，睡眠持续时间延长。与正常组比较，模型组小鼠血清NE、DA、ACTH和CRH含量升高，5-HT含量降低。与模型组比较，半夏组小鼠血清NE含量升高，延胡索组5-HT含量升高，其余各给药组小鼠血清NE、DA、ACTH和CRH含量降低，5-HT含量降低。结论：酸枣仁、延胡索、百合、地黄、半夏、夏枯草6味安神中药具有改善小鼠睡眠的作用，酸枣仁、延胡索、百合、地黄适用于睡后易醒的患者，半夏、夏枯草可以广泛用于失眠患者。其作用机制可能与降低脑内DA、NE、ACTH、CRH水平有关。

1 材料与方法

1.1 实验动物 昆明小鼠，雄性，体质量(18～22)g，共168只。由河北医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2018-004。实验动物饲养于恒温恒湿、明暗各12 h的清洁级实验室内，自由进食摄水。该实验通过河北中医学院伦理委员会伦理审查。

1.2 实验药物 炒酸枣仁15 g，醋延胡索10 g，百合15 g，生地黄15 g，清半夏9 g，夏枯草15 g，选用广东一方制药有限公司生产的中药配方颗粒剂，生产批号分别为：9070783；9061383；9071273；8120113；9051013；9040013，将药物加入100℃蒸馏水中，加热搅拌使其充分溶解，浓缩至所需浓度：炒酸枣仁(0.225 g/mL)、醋延胡索(0.15 g/mL)、百合(0.225 g/mL)、生地黄(0.225 g/mL)、清半夏(0.135 g/mL)、夏枯草(0.225 g/mL)。将配置好的药液置于4℃冰箱中贮存备用。戊巴比妥钠(德国进口分装，批号：020402)。对氯苯丙氨酸(PCPA)，美国Sigma公司，批号：1001542324，将其充分研磨，用弱碱性生理盐水助溶，临用时配成40 mg/mL的混悬液。

1.3 实验试剂与仪器 去甲肾上腺素(NE)酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(批号RE59261)、多巴胺(DA) ELISA试剂盒(批号RE59161)、五-羟色胺(5-HT)ELISA试剂盒(批号RE59121)均购于德国IBL International GmbH公司； 垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)ELISA试剂盒(批号EKE-001-21)、下丘脑促肾上腺皮质激素释放素(CRH) ELISA试剂盒(批号EKE-019-06)，均购于PhoenixBiotech公司。1-15K高速冷冻离心机(美国Sigma公司)；MK3FC酶联免疫检测仪(美国Thomer Fisher公司)。

1.4 6味安神中药对戊巴比妥钠阈上、阈下剂量镇静催眠作用的影响

1.4.1 分组与给药:168只雄性昆明小鼠，随机分为7组：正常组、酸枣仁组、延胡索组、百合组、地黄组、半夏组、夏枯草组，每组24只。各组小鼠的给药剂量参照2015年版《中华人民共和国药典》中规定的成人一日最大用量，根据人和动物体表系数折算为：炒酸枣仁：2.25 g/kg、醋延胡索：1.50 g/kg、百合：2.25 g/kg、生地黄：2.25 g/kg、清半夏：1.35 g/kg、夏枯草：2.25 g/kg。正常组给予等剂量的生理盐水灌胃，各给药组分别给予相应的治疗药物灌胃，每次用药体积为0.01 mL/g，1次/d，连续10 d。

1.4.2 观察指标:第10 d灌胃给药50 min后，每组随机选择12只小鼠腹腔注射3.5 mg/mL戊巴比妥钠水溶液0.1 mL/10 g，观察注射后30 min内每组小鼠入睡只数并计算睡眠发生率。选择剩余12只小鼠腹腔注射4.5 mg/mL戊巴比妥钠水溶液0.1 mL/10 g，观察并记录注射后30 min内每组小鼠的睡眠潜伏期及睡眠持续时间。从开始注射戊巴比妥钠到翻正反射消失时间为入睡潜伏期，从翻正反射消失到翻正反射恢复时间为睡眠时间。实验中以动物翻正反射消失达 1 min 为入睡指标，以 30 s内翻转达3次为睡眠结束指标。

1.5 6味安神药对PCPA失眠小鼠的影响

1.5.1 动物分组及模型建立:将96只雄性昆明小鼠，适应性喂养1周后，随机分为8组：正常组、模型组、酸枣仁组(2.25 g/kg)、延胡索组(1.50 g/kg)、百合组(2.25 g/kg)、地黄组(2.25 g/kg)、半夏组(1.35 g/kg)、夏枯草组(2.25 g/kg)，每组12只。参阅文献[10]，采用腹腔注射PCPA法复制失眠小鼠模型，模型组和给药组小鼠按40 mg/100 g腹腔注射PCPA，1次/d，连续2 d；正常组腹腔注射等剂量的生理盐水。以小鼠昼夜节律消失，不再表现为昼伏夜精，而是日间与夜间皆活动不断为模型建立成功的标志。

1.5.2 标本采集 末次给药后，各组小鼠摘眼球取血，离心15 min(4 000 r/min)，分离血清，待检测相关神经递质指标。随后立即取脑组织，于冰台上分离下丘脑、垂体，置于冻存管中液氮冻存，-80 ℃冰箱保存，待检测脑组织匀浆神经递质含量。

1.5.3 神经递质的检测 用ELISA方法检测血清NE、DA、5-HT和垂体ACTH和下丘脑CRH的含量，严格按照试剂盒说明书步骤进行。

1.6 统计学方法 采用 IBM SPSS 21.0 软件进行数据分析，进行正态性检验，满足正态性，采用单因素方差分析；不满足正态性，采用Kruskal-Wails H秩和检验。各组数据以均数±标准差表示，以P<0.05 表示差异有显著性。

2 结果

2.1 睡眠只数、睡眠潜伏期、睡眠持续时间 与正常组比较，各给药组小鼠睡眠只数增加，睡眠发生率提高，睡眠持续时间显著延长(P<0.01)，除百合组外，其余给药组睡眠潜伏期显著缩短(P<0.01)，百合组虽然差异无显著性(P﹥0.05)，但从数值上可以看出也可以缩短睡眠潜伏期。6味安神药中，睡眠发生率最高的是地黄组，半夏组睡眠潜伏期最短、睡眠持续时间最长。详见表1、表2。

表1 6味安神中药阈下剂量戊巴比妥钠 睡眠协同实验小鼠睡眠只数

表2 6味安神中药阈上剂量戊巴比妥钠睡眠协同实验小鼠睡眠潜伏期、睡眠持续时间

2.2 实验小鼠血液中NE、DA、5-HT的含量变化 与正常组比较，模型组小鼠NE、DA含量显著升高(P<0.01)，5-HT含量显著下降(P<0.01)。与模型组比较，除半夏组外，其余各给药组NE含量显著降低(P<0.05，P<0.01)；所有给药组DA含量降低(P<0.01)；延胡索组5-HT含量升高，其余各给药组5-HT含量降低(P<0.01)。详见表3。

表3 各组小鼠血液中NE、DA、5-HT的含量变化

2.3 实验小鼠脑组织中ACTH、CRH的含量变化 与正常组比较，模型组小鼠ACTH、CRH含量显著升高(P<0.01)。与模型组比较，各给药组小鼠ACTH含量显著降低(P<0.01)；各给药组小鼠CRH含量显著降低(P<0.01)，但地黄组降低幅度明显小于其他给药组。详见表4。

表4 各组小鼠脑组织ACTH、CRH的含量变化

3 讨论

戊巴比妥钠阈上剂量、阈下剂量协同睡眠实验是评价药物催眠功效的经典方法[11]。本研究通过采取此种方法，观察并记录小鼠的睡眠发生率、睡眠潜伏期和睡眠持续时间，从而明确6味具有安神作用的中药的镇静催眠作用。

睡眠是一种调节中枢神经系统的过程，其发生与中枢神经递质如 NE、DA、5-HT等的水平有关[12]。NE、DA是中枢神经系统的兴奋性神经递质，NE是一种参与觉醒的单胺类神经递质，其释放量增加会引起交感神经系统活性增强，导致觉醒增加[13]。DA降低可减少觉醒次数，有助于促进睡眠[14]。5-HT是中枢神经系统的抑制性神经递质，参与睡眠—觉醒过程，延长非快速眼动睡眠, 从而抑制觉醒, 增加深度睡眠并缩短入眠期和浅睡期，被称为脑内的“致眠因子”，对睡眠的发生和维持起着重要作用[15-16]， NE与5-HT在睡眠调节过程中呈一定的消长关系，5-HT水平升高时，NE释放量则相对减少，继而产生正常睡眠[17]。

下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴功能亢进，负反馈调节能力下降，是导致失眠的一个重要原因[18]。下丘脑释放CRH, CRH作用于垂体后使其释放ACTH，大剂量外源性的CRH补给可使健康人群夜间清醒度提高,睡眠效率降低[19]。

酸枣仁归心、肝二经，《名医别录》中记载：“治烦心不得眠，虚汗，烦渴，补中益肝气。”可以养心安神。现代药理学表明，酸枣仁总皂苷和JuA、JuB等单体成分是其镇静安神，改善睡眠的主要成分[20]。实验结果显示，酸枣仁组DA、NE、5-HT含量较模型组相比，低于模型组，PCPA为5-HT合成抑制剂，足量给予时可维持失眠状态长达2周之久[10]，而5-HT 可以缩短入眠期和浅睡期，所以酸枣仁对于5-HT水平降低的失眠疗效不好；NE、DA降低可以减少觉醒次数，提高睡眠质量，因此酸枣仁用于镇静安神更适用于睡后易醒的失眠患者而不适用于不易入睡的患者。

延胡索归肝、脾二经，具有活血、行气、止痛的功效，能行血中气滞，气中血滞。有研究表明延胡索主要药效成分生物碱，具有镇静、催眠、镇痛等药理作用[21]。实验结果显示，延胡索可以显著降低DA、NE水平，减少觉醒次数；显著升高5-HT水平，延长非快速眼动睡眠, 从而抑制觉醒。延胡索能降低ACTH和CRH水平，但相比其他组而言，降低效果不显著，故延胡索在降低夜间清醒度的方面作用不显著。因此，延胡索用于镇静安神更适用于睡后易醒的失眠患者，而不适用于早醒的患者。

百合入心、肺经，性微寒，有清心除烦、宁心安神之功[22]，其作用机制可能与增加单胺类神经递质释放、抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴亢进有关[23]。实验结果显示，百合组调节神经递质的水平均较好，尤其在降低NE水平方面效果最好，因此百合可以广泛用于各种失眠患者，尤其是睡后易醒的患者。

实验选用生地黄，性寒，味甘、苦，有清热凉血、养阴生津之功。实验结果显示，地黄组调节神经递质的水平均较好，因此地黄可以广泛用于各种失眠患者。基于《金匮要略》中的百合地黄汤，临床中百合地黄常配伍使用，养心肺之阴, 清心肺虚火。因此，百合、地黄用于镇静安神更适用于阴虚火旺，睡后易醒的失眠患者。

半夏性温，味辛，能燥湿化痰，《医学衷中参西录》中记载:“半夏：味辛，性温，有毒。凡味辛之至者，皆禀秋金收降之性，故力能下达为降胃安冲之主药。为其能降胃安冲，所以能止呕吐，能引肺中、胃中湿痰下行，纳气定喘。能治胃气厥逆、吐血、衄血。”[24]夏枯草性寒、味辛、苦，有清火明目、散结消肿之功。《冷庐医话》曰：“盖半夏得阴而生，夏枯草得阳而长，是阴阳配合之妙也。”失眠正是一种阳不入阴之阴阳失调的疾病[25]。有研究表明，半夏与夏枯草配伍对治疗失眠疗效良好[26]。实验结果显示，半夏组和夏枯草组在调节神经递质水平方面相对于其他组效果最显著，因此二者无论单味药使用还是配伍使用都可以广泛用于失眠患者，无论是早醒、睡后易醒还是不易入睡的患者皆可使用。

综上所述，酸枣仁、延胡索、百合、地黄、半夏、夏枯草6味安神中药均对改善小鼠睡眠作用有一定效果，均可缩短睡眠潜伏期、延长睡眠持续时间。对治疗失眠有一定的疗效，酸枣仁、延胡索、百合、地黄适用于睡后易醒的患者，半夏、夏枯草可以广泛用于失眠患者。其作用机制可能与降低脑内DA、NE、ACTH、CRH水平有关。