嘧菌环胺·异菌脲可湿性粉剂在葡萄和土壤中的残留消解动态及风险评估

刘 茜 张 宪 陈 敏 尹 全 杨晓凤

（1.四川省农业科学院分析测试中心，成都610066； 2.中国绿色食品发展中心，北京100081）

葡萄属于浆果族水果，其丰富的营养价值颇受消费者的喜爱[1]。葡萄皮含有丰富的天然色素和白藜芦醇等抗氧化物质，不但对人体内糖类的分解有积极的促进作用，且有助于抵抗和预防皮肤癌[2]。葡萄中富含花青素和类黄酮，这两类物质都是强力抗氧化剂，可以减少皮肤上产生皱纹和缓解老年人视力退化[3]。葡萄籽含有多酚类、油脂类、氨基酸、维生素和矿物质等物质，防治过敏、癌症、衰老等疾病[4]。葡萄是世界上产量最大的水果之一[5]。在葡萄的生长过程中，灰霉病严重影响其产量和品质，为此，我国从国外引进嘧菌环胺和异菌脲，广泛应用于防治葡萄灰霉病[6]，并已制定葡萄中嘧菌环胺和异菌脲的最大残留限量 （MRL）分别为20 mg/kg 和10 mg/kg[7]。

嘧菌环胺和异菌脲（结构式见图1）[8]均属于杀菌剂，单剂已在番茄、苹果、葡萄、人参、黄瓜、辣椒、马铃薯、西瓜、香蕉、小油菜进行了农药残留登记，但两种复配剂尚未登记[9]。目前对嘧菌环胺在人参、柑橘、草莓上的药效试验，病菌的敏感性试验和动态消解及膳食风险评估试验已有研究[10～12]，对异菌脲在杨梅等作物上也有不同方向的研究[13]，但对两种农药在葡萄和土壤中的残留消解及风险评估尚未见探究。本文于2016－2017 两年分别在辽宁省和四川省在良好农业规范 （good agricultural practices，GAP）条件下开展60%嘧菌环胺·异菌脲可湿性粉剂在葡萄和土壤中的田间试验，且在良好实验室规范 （good laboratory practice，GLP）条件下分析两地葡萄和土壤的残留消解规律并进行风险评估，旨在为嘧菌环胺和异菌脲在葡萄生产中的应用提供科学依据，同时也为关注嘧菌环胺和异菌脲在土壤环境中的残留趋势提供参考。

图1 嘧菌环胺（a）和异菌脲（b）化学结构式

一、材料与方法

（一）试剂及仪器

1.试剂。嘧菌环胺、异菌脲标准品 （纯度99.96%、99.82%，德国Dr.Ehrenstorfer 公司），丙酮、甲苯、乙腈 （色谱纯，美国Fisher 公司），氯化钠 （分析纯，上海中化试剂公司），石墨化碳－氨基复合柱（500 mg/6 mL，DIKMA 公司）。

2.仪器。气相色谱－串联质谱仪（SHZMADZU TQ－8040），配有三重四极杆质量分析器，HP－5MS （0.25 μm×30 m×0.25 mm）色谱柱，多反应监测模式 （multiple reaction monitoring，MRM），日本岛津公司； 高速匀浆机 （IKA－T18 basic，德国IKA 公司)、旋转蒸发仪 （Rotavapor R－210，瑞士BUCHI 公司）、多功能食品料理机 （博朗3205，德国BRAUN 公司）。

（二）田间试验本研究的田间试验分为消解动态和最终残留试验两部分。试验于2016－2017两年分别在辽宁省沈阳市太子河区东宁卫乡和四川省成都市龙泉驿区山泉镇进行。田间试验方案根据《农药登记残留田间试验标准操作规程》[14]和NY/T 788－2004 《农药残留试验准则》[15]设计。辽宁省和四川省供试作物及其品种分别是葡萄“贝达” 和葡萄 “巨峰”，被试物60%嘧菌环胺·异菌脲可湿性粉剂由山东亿嘉农化有限公司提供。

1.消解动态试验。葡萄： 以制剂500 倍液（有效成分1200 mg/kg）于葡萄果实为成熟期1/2 大小时施药，小区面积30 m2，重复处理3 次，处理间设保护间隔区，另设清水空白对照。土壤： 选一块10 m2的土地单独施药，施药浓度为1000 g a.i./hm2（制剂0.17 g/m2），施药次数1 次，另设清水空白对照。葡萄和土壤均施药后2 h 和1、3、5、7、10、14、21、28、35 d 采样。

2.最终残留试验。葡萄： 根据收获期向前推算确定施药时期，两个施药剂量，低剂量制剂1000倍液（有效成分600 mg/kg），高剂量制剂666.7 倍液（有效成分900 mg/kg）。低剂量和高剂量各设2次和3 次施药处理，每个处理3 次重复，小区面积30 m2，施药间隔期7 d，末次施药后间隔7、14、21 d 采集样品。另设清水空白对照，处理间设保护带。土壤： 土壤的施药时间、施药量和小区面积与葡萄一致。

3.样品采集制备与保存。葡萄： 用随机方法在试验小区内上、下、左、右不同部位采集6 串以上生长正常、无病害、确已着药、成熟的葡萄果实，每小区采集葡萄样本不少于2 kg，装入样本容器中包扎妥当，8 h 内运回实验室，用多功能食品加工机捣碎成浆液，混合均匀后，分取150 g 两份，装入样品盒密封，贴好标签后立即放于－20℃冰柜中保存。土壤： 在试验小区内葡萄树冠下，用土钻随机采取0～15 cm 土壤样本，采样6～12 点，每小区每次采样不少于2 kg，装入样本容器中包扎妥当，8 h 内运回实验室，碾碎，过筛，混匀缩分后保留200 g 左右两份，分别装入可封口的样品袋中，贴好标签后立即将样品放于－20℃冰箱中保存。

（三）分析方法

1.前处理。（1）提取。称取10 g（精确至0.001 g）葡萄和土壤试样于50 mL 离心管中，准确加入20.0 mL 乙腈，15000 r/min 高速匀浆2 min，滤液全部过滤到装有3～5 g NaCl 的50 mL 比色管中，盖上塞子，振荡1 min，在室温下静置1 h，待乙腈相和水相分层。准确吸取10.0 mL 上清液于10 mL比色管中，待净化。（2）净化。用5 mL 乙腈+甲苯（3∶1，V∶V）预淋活化石墨化碳/ 氨基复合柱，待柱液面近干时，将上述待净化溶液转入小柱中，开始收集，再用15 mL 乙腈+甲苯 （3∶1，V∶V）淋洗，收集洗脱液于150 mL 浓缩瓶中，浓缩，用正己烷+丙酮 （9∶1，V∶V）定容至5 mL，装瓶，部分样品上机浓度根据标准曲线浓度稀释相应倍数后，待GC－QqQ－MS/MS 测试。

2.GC－QqQ－MS/MS 检测条件。色谱升温程序： 初始温度150℃，以10℃/min 升至260℃，再以20℃/min 升至300℃，保持2 min； 载气为氦气，流速为1.0 mL/min； 进样口温度60℃； 进样量1 μL； 进样方式为不分流进样； 电子轰击源70 eV； 离子源温度230℃； GC－MS 接口温度300℃；监测参数见表1。

3.标准工作曲线。分别称取一定量的嘧菌环胺和异菌脲，用丙酮稀释为1000 mg/L 标准储备液，置于0℃以下冰柜贮存待用； 用丙酮稀释标准储备液至100 mg/L，然后分别用葡萄和土壤的空白基质溶液逐级稀释至0.010、0.050、0.10、0.20、0.50 mg/L 的混合标准溶液，按照上文的检测条件上机测试，分别以嘧菌环胺和异菌脲的质量浓度（x，mg/L）为横坐标，以峰面积（y）为纵坐标，绘制葡萄和土壤的标准曲线。

4.添加回收试验。在葡萄空白对照样品中添加0.010、0.20、2.5 和20 mg/kg （10 mg/kg）4 个不同浓度的嘧菌环胺和异菌脲，在土壤空白对照样品中添加0.010、0.20 和2.5 mg/kg 3 个不同浓度的嘧菌环胺和异菌脲进行添加回收试验，每个添加水平做5 个平行，分别计算平均值和相对标准偏差（RSD%）。

表1 嘧菌环胺和异菌脲的GC-QqQ-MS/MS 参数

（四）消解动力学根据文献报道，消解速率可利用一级动力学模式进行评价，公式即Ct＝C0e－kt[16]，t（d）表示样品的采收间隔期，Ct（mg/kg）代表在t时采收样品中的农药残留量，C0（mg/kg）是原始沉积量，k表示消解速率。公式中C0用2 h的残留量进行分析，DT50代表农药消解半衰期，根据DT50＝ln2/k 计算。

（五）风险评价农药的风险评价指标很多，本文中选择两种指标，一种是利用农药的膳食暴露健康风险危害指数 （HI），其用农药的每日膳食暴露量（EDI）与每日允许摄入量（ADI）的比值危险商（HQ）判断； 另一种是对农药的长期摄入量膳食风险商 （RQ）进行评价。当HI、HQ和RQ均小于100%，则代表风险是可接受的，相反则会对人类健康存在潜在的风险。

公式 （1）中，EDI（mg/kg d）为每日膳食暴露 量；C（mg/kg）为 样 品 中 农 药 残 留 量；Fi（kg/d）为一般人群每日对某一食品的消费量；bw（kg）为人群平均体重[17]。

公式（2）中，HI（%）为危害指数；HQ（%）为危险商；ADI（mg/kg d）为每日允许摄入量[18]。

公式（3）中，NEDI（mg/kg bw）为国家估计每日摄入量；STMRi（mg/kg）为农药在某一食品中的规范残留试验中值；STMR－Pi（mg/kg）为用加工因子校正的规范残留试验中值。

公式（4）中，RQ（%）为农药的慢性膳食摄入风险商值[19]。

二、结果与讨论

（一）方法的标准工作曲线在0.010～0.50 mg/L 线性范围内，葡萄和土壤样品中嘧菌环胺、异菌脲的峰面积（y）与农药的进样浓度（x）之间呈现良好的线性关系，其线性方程及定量限等见表2。

表2 嘧菌环胺和异菌脲在葡萄和土壤中的线性方程、相关系数和定量限（LOQ）

表3 嘧菌环胺和异菌脲在葡萄及土壤中的添加回收率和相对标准偏差 （n＝5）

（二）回收率和精确度嘧菌环胺和异菌脲在葡萄及土壤样品中的添加回收率和相对标准偏差（n＝5）测定结果见表3。由结果可见，按照上文中前处理、GC－QqQ－MS/MS 检测条件，在葡萄空白样品中，添加水平浓度嘧菌环胺和异菌脲的平均回收率分别为92%～108%和84%～105%，相对标准偏差分别为1.1%～3.8%和3.5%～6.4%，土壤样品中嘧菌环胺和异菌脲的平均回收率分别为95%～106%和98%～100%，相对标准偏差分别为0.4%～2.9%和1.2%～5.7%，均符合NY/T 788－2004 《农药残留试验准则》 中残留物的检测方法要求，表明该检测方法是可行的。葡萄样品中嘧菌环胺和异菌脲标准样品典型谱图见图2。

图2 葡萄嘧菌环胺（a）和异菌脲（b）标准样品色谱图

图3 葡萄中嘧菌环胺（a）与异菌脲（b）的消解趋势

图4 土壤中嘧菌环胺 （a）与异菌脲 （b）的消解趋势

（三）消解动态2016－2017年葡萄和土壤中嘧菌环胺与异菌脲的消解趋势如图3～图4 所示，具体试验结果见表4。由结果可见，均符合一级动力学方程，随着采样间隔期的增加，农药总体呈现逐渐降低的趋势。受实际生长环境中不可控因素的影响，其中有些采样间隔期残留量突然增大，但最终采样间隔期35 d 时消解率在90%以上，在土壤中消解半衰期均＜30 d，说明嘧菌环胺和异菌脲属于易降解的农药。在葡萄中的半衰期在不同年份同一地点的差异不大，但在土壤中的半衰期在不同年份同一地点差异显著，这可能与当年施药时间、气温、降水量、土壤中微生物的菌群和活跃程度有关。

表4 嘧菌环胺和异菌脲在葡萄及土壤中的消解动态

（四）最终残留以60%嘧菌环胺·异菌脲可湿性粉剂施药2 次，施药间隔7 d，末次施药后7、10、14 d 采集葡萄和土壤样品，测定其嘧菌环胺和异菌脲最终残留量，结果见表5～表6。由结果可见，葡萄中嘧菌环胺和异菌脲的残留量分别为0.35～16 mg/kg 和0.051～4.8 mg/kg，土壤中嘧菌环胺和异菌脲的残留量分别为＜0.010～3.2 mg/kg和＜0.010～0.49 mg/kg。结果表明，随着采样间隔的增加，嘧菌环胺和异菌脲在葡萄和土壤中的残留量均逐渐降低。距最后一次施药时间7 d 后，嘧菌环胺和异菌脲在葡萄的残留量均低于我国制定的最大残留限量值，且土壤中嘧菌环胺和异菌脲的残留量值低于葡萄中的相应残留值，对环境的风险影响相对较小。

表5 葡萄中嘧菌环胺和异菌脲最终残留数据

表6 土壤中嘧菌环胺和异菌脲最终残留数据

（五）风险评估一般人群对某种食品的消费量参见《2002年中国居民营养与健康现状》，其中水果的日均消费量为0.0457 kg/d，人群的平均体重按照63 kg 计算，嘧菌环胺和异菌脲的ADI值分别为0.03 mg/kg bw 和0.06 mg/kg bw （GB 2763－2019），根据上文中风险评价的计算公式，分别对葡萄中嘧菌环胺和异菌脲的残留中值、残留最大值和最大残留限量值进行风险评估，其HI、HQ和RQ值见表7。试验数据显示，采样间隔7 d 之后葡萄中嘧菌环胺和异菌脲的HQ、HI、RQ均小于100%，对人体健康风险较小且可控。

表7 嘧菌环胺和异菌脲在葡萄中的风险评估

三、结论

根据推荐用量、施药次数和采收间隔期，对60%嘧菌环胺·异菌脲可湿性粉剂在葡萄和土壤中进行两年两地试验，嘧菌环胺在葡萄和土壤的半衰期是6.6～11.2 d，异菌脲在葡萄和土壤的半衰期是1.7～18.7 d。江景勇等[12]和颜丽菊等[13]的研究结果显示，嘧菌环胺在草莓中的消解半衰期为5.776 d，异菌脲在不同品种的杨梅果实中的半衰期有差异，在“东魁杨梅” 中的半衰期为9.20 d，在 “临海早大梅” 中的半衰期为13.86 d，这与本试验一致，同一作物不同品种的半衰期有一定差异。采收期间隔7 d 以后，嘧菌环胺在葡萄中的残留量低于我国最大残留限量值，但大于CAC、美国、澳大利亚、韩国、欧盟、日本制定的嘧菌环胺在葡萄中的最大限量值，因此在葡萄出口贸易中应注意嘧菌环胺残留量超标问题。采收期间隔7 d 以后，异菌脲在葡萄中的残留量低于上述国家制定的最大残留限量值。嘧菌环胺和异菌脲复配剂的相互作用也可能会影响在葡萄和土壤中的消解半衰期和最终残留量，还有待进一步探究。

我国已制定嘧菌环胺和异菌脲在葡萄中的最大残留限量值 （MRL），结合两年两地的农药残留量，分别对其各个采样间隔期的残留量中值、残留量最大值和最大残留限量值进行风险评估，从风险评估指标危险商和风险商上看，采样间隔期7 d 以后，其均小于100%，表明嘧菌环胺和异菌脲对一般人类的健康不会产生危险。