SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC联合检测在肺癌诊断中的应用*

杨德平，张 萍，金慧敏，张 艳，郑江花

上海健康医学院附属周浦医院医学检验科，上海 201318

肺癌是人类病死率最高的肿瘤之一[1]。由于吸烟、空气污染和社会人口老龄化等因素影响，中国肺癌的发病情况更加突出[2]。著名的英国肿瘤学家PETO教授曾预测，到2025年，中国将每年有高达100万的新发肺癌患者[3]。据我国癌症中心数据报道，每年有78万新发肺癌病例,其中有70万患者病死。据闵佩红等[4]报道，我国75%的肺癌患者在就诊时已属晚期，5年生存率约16.1%。因此，寻找有效的早期筛查方法，是提高肺癌患者生存率及早期干预治疗的关键[5]。目前，诊断肺癌最常用的是内镜检查技术，这项技术特异度和灵敏度较高，但它是有创侵入性操作，例如支气管镜等，会给患者带来额外痛苦[6]。鳞状细胞癌相关抗原(SCC)、癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)等肿瘤标志物也是临床上常用的肺癌辅助诊断指标，但研究表明单独检测这些肿瘤标志物的灵敏度均低于60%[7]。随着人们对表观遗传学DNA甲基化的认识，人们发现DNA甲基化异常存在于许多人类恶性肿瘤中，在肿瘤形成的早期即发生，是许多肿瘤的里程碑事件[8-9]。有研究提示，SHOX2和PTGER4基因的高度甲基化能导致患者抑癌功能沉默，促进癌症发生，其基因的甲基化在肺癌发生的早期即可出现，这2个基因甲基化检测可对目前肺癌的常规诊断方法给予补充[10-11]。同时血浆中SHOX2和PTGER4基因甲基化情况可以提示肺结节患者病变的良恶性，减少患者不必要的有创检查[11]。但关于血浆 SHOX2和PTGER4基因甲基化在肺癌诊断中的临床研究仍较少。因此，本研究通过SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC联合检测,探讨这3项指标辅助诊断肺癌的临床价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 纳入标准：根据《2007中国肺癌临床指南》和《中国肺部结节分类、诊断与治疗指南(2016年版)》诊断为肺癌和肺部良性疾病的患者。选择2019年1月至2020年5月在上海健康医学院附属周浦医院就诊、符合上述标准的患者共104例，其中肺癌(肺癌组)48例，男26例、女22例，年龄33～92岁、平均(66.77±13.22)岁，肺鳞癌20例、小细胞肺癌(SCLC)6例、非鳞非小细胞肺癌 (NSCLC)22例；56例良性肺病患者(良性肺病组)中，男25例、女31例，年龄26～89岁、平均(61.25±15.32)岁。两组患者性别、年龄差异均无统计学意义(P>0.05)，有可比性。

1.2仪器与试剂 Cyfra21-1和神经元特异性烯醇化酶(NSE)采用新产业Maglumi 800全自动化学发光分析仪及配套试剂进行检测，SCC和CEA采用雅培I2000全自动免疫分析仪及配套试剂进行检测。SHOX2和PTGER4基因甲基化采用美国ABI公司7500荧光定量PCR仪及北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司提供的人SHOX2和PTGER4基因甲基化检测试剂盒进行检测。

1.3方法

1.3.1肿瘤标志物检测 用含促凝剂的真空采血管采集患者3 mL静脉血，室温静置离心后上机。采用新产业Maglumi 800全自动化学发光分析仪和雅培I2000全自动免疫分析仪及配套试剂检测血清中SCC、CEA、Cyfra21-1和NSE水平。检测过程严格按照说明书操作。

1.3.2血浆SHOX2和PTGER4基因甲基化检测 用血浆游离DNA保存管采集患者10 mL静脉血，缓慢颠倒10次，让血液与管内成分充分混匀，以3 000 r/min 离心10 min后，吸取上清液进行游离DNA提取，提取好的DNA在-20 ℃条件下保存待检。采用美国ABI公司7500荧光定量PCR仪及北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司提供的人SHOX2和PTGER4基因甲基化检测试剂盒检测游离DNA中SHOX2和PTGER4基因甲基化情况。检测过程严格按照说明书操作。

2 结 果

2.1两组患者SHOX2、PTGER4基因甲基化及部分肿瘤标志物水平比较 两组患者CEA、Cyfra21-1、NSE水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。肺癌组患者SHOX2、PTGER4基因甲基化阳性率分别为66.7%(32/48)和39.6%(19/48)，明显高于良性肺病组[25.0%(14/56)和5.4%(3/56)]，差异有统计学意义(χ2=18.191、16.159，P<0.01)。肺癌组患者血清SCC水平高于良性肺病组，差异有统计学意义(t=2.943，P<0.01)。见表1。

表1 两组患者SHOX2、PTGER4基因甲基化及部分肿瘤标志物水平比较

2.2多因素Logistic回归分析肺癌影响因素 以是否患有肺癌(赋值：否=0，是=1)为因变量，以SHOX2基因甲基化、PTGER4基因甲基化、SCC值为自变量进行多因素 Logistic 回归分析，结果显示，SHOX2、PTGER4基因甲基化及SCC是促使肺癌发生的影响因素(P<0.05)。见表2。

表2 SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC诊断肺癌Logistic回归分析

2.3ROC曲线分析诊断肺癌的相关指标 以SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC为检验变量，以是否患有肺癌为分类变量绘制 ROC曲线，结果显示这3项指标单独检测诊断肺癌的AUC最高为0.720，灵敏度最高为74.1%，特异度最高为94.6%。而当 SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC联合诊断肺癌时，AUC为0.826，灵敏度提高到77.8%，特异度为90.0%，相比这3项指标单独检测，联合检测诊断肺癌的AUC和灵敏度都有所提高，尤其是联合检测的灵敏度从单项检测的39.6%提高到77.8%。见表3和图1。

表3 SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC诊断肺癌ROC曲线分析

图1 不同指标诊断肺癌的ROC曲线

2.4肺癌组不同病理类型患者血浆中SHOX2、PTGER4基因甲基化及血清SCC水平比较 肺癌组不同病理类型患者之间，血浆中SHOX2、PTGER4基因甲基化阳性情况比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。患者血清中SCC水平在肺鳞癌与SCLC、非鳞NSCLC比较中，差异均有统计学意义(P<0.05)，肺鳞癌患者血清SCC水平明显高于其他病理类型的肺癌。而血清中SCC水平在SCLC与非鳞NSCLC比较中，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 肺癌组不同病理类型患者血浆中SHOX2、PTGER4基因甲基化及血清SCC水平比较

3 讨 论

目前分子靶向治疗和免疫抑制剂的应用已明显提高了晚期肺癌的生存率，但肺癌的病死率仍然很高。我国肺癌患者发现时大多数已是晚期，因此，早期发现肺癌是提高患者生存率的关键。肺癌的发生、发展涉及多种因素，其中以异常的DNA甲基化为主，整个基因组DNA的低甲基化和DNA启动子区CpG岛高甲基化在肺癌的发病机制中起着重要作用[12]。DNA甲基化伴随着肺癌发展的全过程，故其有望成为肺癌诊断的分子标志物[13]。 SHOX2是一种同源盒基因，其基因序列中有2个CpG岛[14]。研究发现，SHOX2基因在许多恶性肿瘤中，如肾癌、乳腺癌和肺癌等，都异常表达[15]。有研究显示，对肺癌患者的癌细胞进行全基因组和多重甲基特异性甲基化实验分析，SHOX2基因在大多数肺癌患者的癌组织中高度甲基化[15]，SHOX2基因甲基化可能是肺癌诊断的辅助指标。PTGER4基因位于染色体5p13.1上，研究表明，敲除该基因或使用其拮抗剂可抑制NSCLC的生长，与SHOX2基因联合检测，可提高肺癌检出率和诊断准确性[16]。

本研究在检测SHOX2、PTGER4基因甲基化的同时也检测临床上一些肺癌常用的肿瘤标志物，如SCC、CEA、Cyfra21-1和NSE。本研究结果显示，肺癌组患者SHOX2、PTGER4基因甲基化阳性率分别为66.7%和39.6%，明显高于良性肺病组，差异均有统计学意义(P<0.05)，此结果与夏冬平等[17]、初霞等[11]关于SHOX2、PTGER4基因甲基化诊断肺癌的研究结果具有较好的一致性。肺癌组患者的血清SCC水平高于良性肺病组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示肺癌的发生与该指标密切相关，有待进一步研究分析。而CEA、Cyfra21-1、NSE水平在肺癌组与良性肺病组之间差异无统计学意义(P>0.05)，这与已有研究结果不相符[17]，可能与收集的标本数量相对过少有关，笔者将加大标本收集数量，做进一步研究。

本研究用多因素Logistic回归对肺癌的影响因素进行了分析，结果显示血浆SHOX2、PTGER4基因甲基化和血清SCC水平是肺癌的独立影响因素(P<0.05)，提示这3项指标在一定程度上可以独立反映肺癌的情况。

为了分析SHOX2和PTGER4基因甲基化及SCC检测对诊断肺癌的价值，本研究进行ROC曲线分析，结果显示SHOX2基因甲基化检测诊断肺癌的AUC为0.720，灵敏度为74.1%，特异度为70.0%；PTGER4基因甲基化检测诊断肺癌的AUC为0.671，灵敏度只有39.6%，但特异度却能达到94.6%；而血清SCC水平诊断肺癌的AUC能达到0.673，灵敏度为70.4%，特异度为55.0%。当笔者将SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC 3项指标进行联合检测，结果显示，与单项指标检测相比，联合检测诊断肺癌的灵敏度从单项最低39.6%提高到77.8%，AUC达到0.826，总体诊断性能得到提高，这也提示这3项指标的联合检测对鉴别诊断肺癌和肺部良性疾病具有较好的价值，可作为诊断肺癌的辅助指标。

最后，本研究分析了SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC水平在肺癌组不同病理类型患者的情况，发现血浆中SHOX2、PTGER4基因甲基化在不同病理类型患者比较中差异无统计学意义(P>0.05)，提示SHOX2、PTGER4基因甲基化在不同病理类型的肺癌中无组织特异性，这与夏冬平等[17]的研究结果有所不同，可能与本研究收集的肺癌例数较少有关。而患者血清中SCC水平在肺鳞癌与SCLC和非鳞NSCLC比较中差异有统计学意义(P<0.05)，与倪军等[7]的研究结果一致，说明肺鳞癌患者血清中SCC水平明显高于其他病理类型的肺癌。

综上所述，SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC联合检测能提高肺癌诊断灵敏度和特异度，在诊断肺癌和肺部良性疾病方面具有较好的价值，可作为非侵入性诊断肺癌较好的辅助指标。