miR-133b通过介导TGF-βR1表达下调对食管癌细胞侵袭、迁移的抑制作用

米卫国，张 伟，刘建军，张昭鹏，杨 帆

陕西省汉中市中心医院胸外科,陕西汉中 723000

食管癌是全球常见的消化道恶性肿瘤，在世界范围内发病率居第7位，病死率居第6位[1]。晚期食管癌患者远处转移是其预后不良和高病死率的主要原因[2-3]。微小RNA(miRNA)是一种具有调节作用的非编码小RNA，通过靶向调节基因表达水平，在癌症的发生、发展和转移中起着重要的作用[4]。有研究报道，miR-133b的表达水平和食管癌的病理分级及预后密切相关[5-6]，与食管癌的恶性进展密切相关。转化生长因子-β受体1(TGF-βR1)是miR-133b的靶基因之一，是转化生长因子-β(TGF-β)/SMAD3信号通路的关键蛋白，TGF-β/SMAD3信号通路激活[7-8]在诱导肿瘤细胞发生上皮间质转化(EMT)，促进肿瘤细胞侵袭和迁移中发挥重要作用[9]。但关于食管癌中miR-133b是否通过调控其靶基因TGF-βR1激活TGF-β/SMAD3信号通路，促进食管癌的侵袭和迁移的研究鲜见报道。因此，本研究拟明确miR-133b通过调控其靶基因TGF-βR1发挥对食管癌侵袭和迁移的作用及机制，为进一步探讨miR-133b作为治疗食管癌侵袭和迁移的作用靶点提供一定的实验基础。

1 材料与方法

1.1材料来源 人食管癌OE19、ECA109细胞，人正常食管上皮细胞(HEEC细胞)均购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)；胎牛血清、RPMI1640细胞培养基购自Hyclone公司；Opti-MEM细胞培养基购自Gibco公司；抗菌药物(青霉素、链霉素)、胰蛋白酶均购自中国Solarbio公司；兔抗TGF-βR1抗体、兔抗SMAD3抗体均购自Cell Signaling Technology公司；兔抗p-SMAD3、兔抗E-cadherin、兔抗N-cadherin、兔抗β肌动蛋白(β-actin)抗体均购自Bioworld Technology公司；RNA提取试剂盒、Trizol、蛋白提取裂解液均购自碧云天生物科技有限公司；miR-133b mimic、miR-133b negative control(miR-133b NC)、WT-TGF-βR1、MUT-TGF-βR1荧光素酶报告基因载体均购自上海吉玛公司；Lipofectamine(R) 3000购自ThermoFisher公司；双荧光素酶报告基因试剂盒(RG027)购自碧云天生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人食管癌OE19、ECA109细胞和HEEC细胞，均采用无菌且含10%胎牛血清和1%抗菌药物(青霉素、链霉素)的RPMI1640培养液在37 ℃、5%CO2的无菌细胞培养箱中培养。

1.2.2实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法 收集对数生长期的人食管癌OE19和ECA109细胞，以HEEC细胞为对照。采用RNA提取试剂盒提取RNA：加入Trizol裂解液，匀浆，加氯仿，室温5 min，离心，转移上层水相，加异丙醇，室温10 min，离心，去上清液，加75%乙醇振荡混合，4 ℃离心，去上清液，EP管放置干燥，加入焦碳酸二乙酯水充分溶解RNA；采用qPCR检测RNA浓度；引物序列设计见表1，反转录合成cDNA，PCR反应(PCR反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s)检测miR-133b基因水平，基因的相对表达水平以2-ΔΔCt计算。引物序列由上海吉玛公司合成并鉴定，见表1。

表1 PCR试验引物序列

1.2.3细胞转染 转染前24 h，将食管癌OE19、ECA109细胞以1×106个/孔的密度接种到6孔板中。次日，冰浴上吸取miR-133b mimic和miR-133b NC各6 μg，用预冷的无血清Opti-MEM培养基250 μL分别稀释，轻轻混匀后，在室温无菌台中静置5 min。同时吸取Lipofectamine(R) 3000转染试剂8 μL，用预冷的无血清Opti-MEM培养基250 μL稀释，轻轻混匀后，在室温无菌台中静置5 min。5 min后，分别混合Lipofectamine(R) 3000转染试剂、miR-133b mimic和miR-133b NC的稀释液，每份500 μL，轻轻混匀，室温无菌台上静置20 min。6孔板中细胞用无血清Opti-MEM培养基漂洗2次，每孔加入混合液500 μL。置于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育6 h，然后更换含10%胎牛血清和1%抗菌药物(青霉素、链霉素)的RPMI1640培养液，继续培养48 h，用于后续实验。

1.2.4Transwell小室实验检测细胞侵袭和迁移能力 迁移实验：取对数生长期的人食管癌OE19、ECA109细胞和转染了miR-133b mimic(过表达miR-133b，OE miR-133b)、miR-133b NC的人食管癌OE19、ECA109细胞，调整细胞密度，吸取0.2 mL细胞悬液接种于24孔板的Transwell小室中，使细胞密度为4×104个/孔，小室下层相应加入含30%胎牛血清培养液600 μL，将Transwell小室置于孵箱中培养。培养24 h后弃掉Transwell小室内外液体，加入磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，然后每孔加入4%多聚甲醛1 mL，在室温条件下固定10 min。弃去多聚甲醛，用PBS洗涤3次。之后在Transwell小室孔中加入0.1%结晶紫1 mL，室温条件下染色10 min。用PBS洗涤3次，棉签擦掉Transwell上室中未迁移的细胞。然后将小室置于显微镜下拍照，随后在新的24孔板中放置小室，并加入33%冰乙酸800 μL进行脱色，振荡5 min使之充分溶解。用酶联免疫检测仪在570 nm波长下读取吸光度值(A570)，观察细胞的迁移能力。

侵袭实验：用无血清的4 ℃预冷细胞培养液在冰浴上稀释Matrigel胶。稀释比例为培养基∶基质胶=9∶1；取100 μL稀释的基质胶加到Transwell上室中，置于37 ℃孵箱中孵育2 h，使基质胶充分胶凝。以下步骤同迁移实验。用酶联免疫检测仪在570 nm波长下读取A570，观察细胞的侵袭能力。

1.2.5蛋白免疫印迹(Western blot)法检测蛋白水平 收集对数生长期的人食管癌OE19、ECA109细胞，收集转染了miR-133b mimic和miR-133b NC的人食管癌OE19、ECA109细胞，每组收集的细胞加入蛋白裂解液220 μL，置冰浴上30 min提取细胞蛋白。以13 000 r/min低温高速离心20 min，弃去细胞沉淀，收集上清液。用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。以40 μg蛋白量作为上样量，在6%浓缩胶、12%分离胶上进行SDS-PAGE电泳。湿法进行电转移，将电泳分离后的蛋白转移至NC膜上。用5%脱脂奶粉室温条件下封闭1.5 h，按照常规滴加一抗(TGF-βR1、SMAD3、p-SMAD3、E-cadherin、N-cadherin、β-actin，1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜。次日常温复温1 h，磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗膜3次，每次5 min。加山羊抗兔二抗(1∶8 000稀释)，室温下孵育1.5 h。然后用PBST洗膜3次，每次5 min。最后在化学发光仪中显影，灰度扫描，以β-actin为内参。结果与β-actin比值做统计分析，检测TGF-βR1、SMAD3、p-SMAD3、E-cadherin、N-cadherin蛋白水平。

1.2.6双荧光素酶报告基因试验检测miR-133b对TGF-βR1的靶向调控 通过TargetScan数据库(http://www.targetscan.org)和miRPathDB数据库(https://mpd.bioinf.uni-sb.de/mirnas.html)检索，分析发现TGF-βR1的3′UTR区域可与miR-133b结合。通过上海吉玛基因有限公司构建野生型(WT)和突变型(MUT)基因靶点TGF-βR1的3′UTR荧光素酶报告基因载体(WT-TGF-βR1和MUT-TGF-βR1)。取对数生长期的人食管癌OE19、ECA109细胞接种于24孔板中，使细胞密度为5×104个/孔。采用Lipofectamine(R)3000转染试剂共转染WT-TGF-βR1、MUT-TGF-βR1和miR-133b NC、miR-133b，共转染36 h后，使用双荧光素酶报告基因试剂盒，严格按照说明书要求，检测萤火虫荧光素酶反应强度和内参海肾荧光素酶反应强度，计算2组数据比值进行统计学分析，观察miR-133b对TGF-βR1的靶向调控，实验重复3次。

2 结 果

2.1miR-133b在人食管癌OE19、ECA109细胞和HEEC细胞中的相对表达水平比较 结果显示，miR-133b在HEEC细胞中的相对表达水平为1.08±0.09，在人食管癌OE19、ECA109细胞中的相对表达水平分别为0.61±0.06、0.53±0.08，与HEEC细胞比较，人食管癌OE19、ECA109细胞中miR-133b的相对表达水平明显下调，差异均有统计学意义(P<0.01)。

2.2成功构建了过表达miR-133b的人食管癌OE19、ECA109细胞 采用miR-133b mimic和miR-133b NC，应用Lipofectamine(R) 3000转染试剂转染人食管癌OE19、ECA109细胞，qPCR检测转染细胞中miR-133b的相对表达水平。结果显示，转染细胞培养48 h后，转染miR-133b NC、miR-133b mimic的HECC细胞中miR-133b的相对表达水平分别为1.03±0.06和0.97±0.06，而转染miR-133b mimic的人食管癌OE19、ECA109细胞中miR-133b的相对表达水平分别为2.57±0.12和2.33±0.13，与HEEC细胞比较，转染miR-133b mimic的人食管癌OE19、ECA109细胞中miR-133b的相对表达水平上调(P<0.01)，表明过表达miR-133b的人食管癌OE19、ECA109细胞构建成功。

2.3miR-133b对人食管癌OE19、ECA109细胞的迁移和侵袭能力的影响 结果显示，与未转染的人食管癌OE19、ECA109细胞和转染miR-133b NC的人食管癌OE19、ECA109细胞比较，转染miR-133b mimic的人食管癌OE19、ECA109细胞的迁移和侵袭能力均降低(P<0.01)，见图1、2。

注：与未转染和转染miR-133b NC的比较，*P<0.01。

注：与未转染和转染miR-133b NC比较，*P<0.01。

2.4miR-133b对人食管癌OE19、ECA109细胞中TGF-βR1/SMAD3信号通路蛋白表达水平的影响 结果显示，与未转染和转染miR-133b NC的人食管癌OE19、ECA109细胞比较，转染miR-133b mimic的人食管癌OE19、ECA109细胞中的TGF-βR1、p-SMAD3、N-cadherin的蛋白水平下降，E-cadherin的蛋白水平升高，差异均有统计学意义(P<0.01)，见图3。

注：A为Western blot检测各蛋白水平；B为各蛋白相对表达水平。与对照比较，*P<0.01。

2.5miR-133b靶向调控TGF-βR1的表达 通过双荧光素酶报告基因试验检测发现，转染WT-TGF-βR1基因表达载体后，与转染miR-133b NC比较，转染miR-133b mimic的WT-TGF-βR1食管癌细胞的相对荧光素酶活性降低(P<0.01)；转染MUT-TGF-βR1基因表达载体后，与转染miR-133b NC比较，转染miR-133b mimic的MUT-TGF-βR1食管癌细胞的相对荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

注：*P<0.01，#P>0.05。

3 讨 论

食管癌发生转移是其预后差、病死率高的主要原因[10]，晚期食管癌转移患者临床治疗多采用化疗及放化疗结合的方法，但由于放疗的耐受性和药物选择性低等问题，其预后不佳，严重影响食管癌患者生活质量，因此迫切需要对调控食管癌发生转移的靶点进行研究[11-12]。

miR-133b在多种肿瘤中发挥重要作用[13]，其在食管癌中的表达低于其癌旁组织，与食管癌的发生、发展密切相关，是治疗食管癌转移的潜在靶标[14]。TGF-βR1是miR-133b的靶基因，miR-133b通过靶向结合TGF-βR1的3′UTR端，负调控TGF-βR1的表达[8]；有研究报道，miR-133b通过调控其靶基因TGF-βR1影响腺癌骨转移及乳腺癌EMT的发生[7-8]。TGF-βR1在诱导食管癌细胞发生EMT，促进食管癌细胞发生侵袭和迁移过程中发挥重要作用[15]，TGF-βR1通过激活TGF-β/SMAD3信号通路，促进SMAD3发生磷酸化。磷酸化SMAD3入核后启动转录翻译，影响目的基因表达，介导肿瘤细胞EMT的发生[9-10]。而在EMT发生、发展过程中，E-cadherin、N-cadherin是标志物蛋白，E-cadherin表达减少，N-cadherin表达升高，减少细胞间黏附力，进而促进肿瘤细胞的侵袭和迁移[16-17]。

本研究通过qPCR检测HECC细胞和食管癌OE19和ECA109细胞中miR-133b的表达水平，结果发现，miR-133b在食管癌细胞中的表达水平明显低于HEEC细胞。通过miR-133b mimic转染食管癌OE19和ECA109细胞，成功构建过表达miR-133b的食管癌OE19和ECA109细胞，以miR-133b NC为对照组，采用Transwell小室实验观察过表达miR-133b的食管癌OE19和ECA109细胞，结果发现，与miR-133b NC比较，过表达miR-133b的食管癌OE19和ECA109细胞的侵袭和迁移能力明显下降(图1、2，P<0.01)，表明miR-133b负调控食管癌细胞的转移能力。进一步机制研究表明，miR-133b靶蛋白TGF-βR1的水平在过表达miR-133b的食管癌OE19和ECA109细胞中明显下调，TGF-βR1/SMAD3信号通路中SMAD3的磷酸化水平明显下降，N-cadherin蛋白水平明显升高，E-cadherin蛋白水平明显降低(图3)。双荧光素酶活性检测结果显示，TGF-βR1的3′UTR区域可与miR-133b结合，miR-133b靶向调控TGF-βR1的表达。

综上所述，miR-133b在食管癌OE19和ECA109细胞中水平明显下调，可显著抑制食管癌细胞的侵袭和迁移能力，其作用机制是通过负调控其靶基因TGF-βR1的蛋白水平，抑制TGF-βR1/SMAD3信号通路活化，进而抑制食管癌细胞EMT的发生而降低其侵袭和迁移的能力。本实验结果将为miR-133b作为食管癌分子标志物的治疗应用提供一定的科学依据。