产新德里金属β-内酰胺酶-1醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体碳青霉烯酶、外膜孔蛋白和外排泵相关基因检测

傅芬蕊，张 娅，潘玉红，曹颖平，郑培烝

不动杆菌属细菌是一群革兰阴性、氧化酶阴性、不发酵糖类的球杆菌，属于条件致病菌，其中鲍曼不动杆菌、Pittii不动杆菌、Nosocomialis不动杆菌和醋酸钙不动杆菌由于遗传背景相似，通过传统的细菌鉴定系统很难在表型上区分开来，故统称为醋酸钙-鲍曼不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus-Acinetobacterbaumannii，Acb)复合体。Acb复合体是引起院内感染和社区获得性感染常见病原体之一，常导致患者泌尿系统、呼吸系统、创面伤口感染及菌血症[1]。

由于抗菌药物的广泛使用，目前不动杆菌属细菌几乎对现有所有种类的抗菌药物的敏感性呈现逐年下降趋势。而碳青霉烯类抗菌药物作为新一代β-内酰胺类抗菌药物，是目前临床上控制革兰阴性菌感染最有效的药物之一，对不动杆菌属细菌具有良好的抗菌作用，是治疗不动杆菌属细菌重症感染的首选抗菌药物。但自1991年美国报道首例碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌(Carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii，CRAB)以来，世界各地耐碳青霉烯类不动杆菌的报道屡见不鲜。不动杆菌主要通过产碳青霉烯酶、外膜孔蛋白的表达缺失或下调、药物的主动外排泵系统活性增强、青霉素结合蛋白位点改变及整合子等遗传元件快速传播耐药基因等的作用导致对碳青霉烯类抗菌药物耐药[2]。本研究对笔者医院分离的10株非重复的对亚胺培南耐药的产新德里金属β-内酰胺酶-1(New Delhi metallo-β-lactamase-1, NDM-1)Acb复合体的耐药机制进行研究，结果报道如下。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集笔者医院血液科、呼吸内科和ICU等科室分离的10株非重复的对亚胺培南耐药的产NDM-1的Acb复合体。

1.2仪器与试剂 全自动微生物分析仪(VITEK-2 compact)、革兰阴性细菌GN鉴定卡、AST-GN16药敏卡片、亚胺培南Etest试纸条、MBL(IP/IPI)Etest试纸条及不动杆菌属REP-PCR分型试剂盒(法国生物梅里埃公司)；PCR扩增仪(2720，美国Applied Biosystems公司)；凝胶成像分析系统(Universal Hood Ⅱ，美国BIO-RAD公司)；超纯微生物DNA提取试剂盒(美国MOBIO司)；Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL)及dNTP(2.5 mmol/L)(北京天根生化科技有限公司)；M-H琼脂(英国Oxoid公司)；生物分析仪(2100)及DiversiLab芯片(美国Agilent公司)；微量紫外可见分光光度计(ND-1000，美国NanoDrop公司)。引物的合成及PCR产物测序由上海博尚生物技术有限公司完成。

1.3方法

1.3.1菌株鉴定与药敏试验 经全自动微生物分析仪进行鉴定和药敏试验，10株Acb复合体均对亚胺培南耐药。采用亚胺培南Etest试纸条对亚胺培南耐药性进行验证，药敏结果根据2019年CLSI的抗菌药物敏感性试验标准进行判断，以大肠埃希菌ATCC 25922为质控菌株，实验过程严格按照《全国临床检验操作规程》进行[3]。通过42 ℃生长实验及PCR法检测OXA-51-like基因与rpoB基因序列分析鉴定具体菌种。PCR的扩增体系为25 μL：上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，1 μL模板DNA，2.5 μL 10×Taq Buffer，2 μL dNTP，0.5 μL Taq 聚合酶(2.5 U/μL)，用灭菌水补至25 μL。反应参数为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 1 min，循环30次；72 ℃延伸10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，采用凝胶成像分析系统进行结果分析。电泳阳性产物送公司测序，所得测序结果通过BLAST与GenBank中的序列进行比对，rpoB基因匹配度≥98%且最高者可认定为该菌种。引物名称、引物序列及预计产物长度见表1。

1.3.2金属酶表型筛选试验 采用MBL(IP/IPI)Etest法，实验过程严格按照产品说明书进行。以大肠埃希菌ATCC 25922作为阴性质控菌株，以本实验室保存的金属酶阳性的大肠埃希菌作为阳性质控菌株。结果参照说明书进行判定：以单药与复合制剂的MIC比值≥8，即IP/IPI≥8，或IP/IPI之间出现幻影圈，或IP与IPI中一项出现畸变圈，判定为金属酶表型筛选试验阳性。

1.3.3碳青霉烯酶基因检测及测序 PCR法扩增常见的A类碳青霉烯酶基因(KPC，GES，SME，IMI/NMC)，B类金属酶基因(NDM-like，IMP-like，VIM-like，SIM-1，GIM-1和SPM)和D类苯唑西林酶基因(OXA-23-like，OXA-24-like，OXA-58-like和OXA-143-like)。NDM-like阳性的菌种扩增NDM基因全长。PCR的扩增体系及条件同上。电泳阳性产物送公司测序，所得测序结果通过BLAST与GenBank中的序列进行比对。引物名称、引物序列及预计产物长度见表1。

1.3.4外膜孔蛋白及外排泵基因检测与测序 利用PCR法检测外膜孔蛋白carO和oprD基因，以及外排泵相关基因(包括adeB，adeI，adeJ，adeK基因和adeS调节基因)。PCR扩增体系和条件同上。阳性产物送公司测序，测序结果与GeneBank中的序列进行比对。引物名称、引物序列及预计产物长度见表1。

表1 扩增耐药基因相关引物信息

1.3.5REP-PCR基因分型 依照超纯微生物DNA提取试剂盒操作说明书提取10株Acb复合体基因组DNA，分光光度计测DNA浓度，调整浓度为25～50 ng/μL。根据不动杆菌属REP-PCR分型试剂盒的要求，应用REP-PCR引物进行扩增，配制25 μL PCR反应体系：2 μL Primer Mix A，2 μL基因组DNA，18 μL PCR MM1，2.5 μL 10×Taq缓冲液，0.5 μL Taq聚合酶(2.5 U/μL)。反应参数为：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s→50 ℃ 30 s→70 ℃ 90 s，循环35次；70 ℃延伸3 min。将扩增产物、凝胶、DNA Marker和Ladder按照说明书顺序注入DiversiLab DNA芯片相应孔中。将上述芯片放入漩涡振荡适配器中，2 200 r/min离心1 min。芯片在5 min内放入生物分析仪进行分析。采用生物分析仪检测结果，并使用DiversiLab分型系统配套软件分析，得到各菌株相应的树状图与虚拟电泳图。根据虚拟电泳图中条带的位置和数目等特征及树状图相似性判断菌株的同源性。同源性判断标准：无差别，树状图相似性>97.5%，且虚拟电泳图没有条带差异；相似，树状图相似性>95%，虚拟电泳图上有1～2个不同的条带或条带的位置不同；不同，树状图相似性<95%，虚拟电泳图上有≥3个不同的条带或条带的位置不同。

2 结 果

2.1菌株鉴定与表型筛查结果 本次共收集到10株耐碳青霉烯类抗菌药物的Acb复合体，其中Pittii不动杆菌5株，Nosocomialis不动杆菌3株，鲍曼不动杆菌2株。经亚胺培南Etest试纸条验证，结果均对亚胺培南耐药。金属酶表型检测试验结果均为阳性(表2)。B类碳青霉烯酶基因、外膜孔蛋白基因和外排泵基因中所列基因为检测阳性的基因。

表2 10株醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体金属酶表型检测与碳青霉烯类耐药相关基因检测结果

2.2碳青霉烯酶基因检测与测序结果 10株不动杆菌NDM-full型基因均为阳性，电泳结果与预计条带大小相近，如图1所示，将PCR产物进行双向测序，并与GenBank中的序列进行比对，证实10株不动杆菌与NDM-1基因序列一致。2株鲍曼不动杆菌OXA-51-like基因均阳性，其中1株OXA-23-like基因阳性；其他检测的碳青霉烯酶基因阴性。5株Pittii不动杆菌中，2株OXA-58-like基因阳性，其他检测的碳青霉烯酶基因阴性。3株Nosocomialis不动杆菌 中，除NDM-1外，其他检测的碳青霉烯酶基因阴性(表2)。将以上阳性扩增产物送由公司进行双向测序，并与GenBank中的序列进行比对，结果符合。

M为100 bp DNA Ladder；N为阴性对照；C14和C50号为鲍曼不动杆菌；A605,606,609,625和640为Pittii不动杆菌；A607,611和615为Nosocomialis不动杆菌。

2.3外膜孔蛋白及外排泵基因检测与测序结果 在外膜孔蛋白基因检测方面，2株鲍曼不动杆菌carO基因均为阳性，oprD基因1株阴性1株阳性；5株Pittii不动杆菌中，carO基因均为阴性，oprD基因均为阳性；3株Nosocomialis不动杆菌中，carO和oprD基因均为阳性。在外排泵基因检测方面，2株鲍曼不动杆菌中，adeB，adeI，adeJ及adeK基因均为阳性；5株Pittii不动杆菌中，adeI及adeK基因均为阳性，4株adeJ基因阳性，1株adeB基因阳性；3株Nosocomialis不动杆菌中，adeB,adeI,adeJ及adeK基因均为阳性。以上菌株均未检测到adeS基因(表2)。

2.4基因分型结果与同源性分析 5株Pittii不动杆菌分为A和B两型，其中A型2株，1株来自血液科二区，1株来自呼吸内科；B型3株，分别来自血液科二区、综合ICU和心外科ICU(图2)。3株Nosocomialis不动杆菌分为A和B两型，其中A型2株，B型1株，均来自血液科二区(图3)。2株鲍曼不动杆菌型别不同(结果未显示)，分别来自神经内科和综合ICU。每组的A与B型之间同源性都较差，图谱上均有超过3个条带的位置不同。

图2 5株Pittii不动杆菌的分型结果

图3 3株Nosocomialis不动杆菌的分型结果

3 讨 论

在探讨不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药机制的研究中，报道较多且最为主要的是产碳青霉烯酶，多见B类金属酶和D类苯唑西林酶(oxacilllinase，OXA)，A类酶少见，其中金属酶水解活性最强。目前在不动杆菌中发现的金属酶有IMP,VIM,SIM和NDM等，其中NDM-1型酶已有较多报道。苯唑西林酶目前已发现200多种型别，按组别可以分为OXA-23,OXA-24,OXA-51,OXA-58和OXA-143组等。在不动杆菌中仅检出NDM-1基因或OXA基因(特别是OXA-23基因)的报道较多，但二者同时检出的相关报道较少，而在Pittii不动杆菌同时检出NDM-1基因和OXA-58-like基因的报道更少，目前仅在马来西亚和我国的广东省有检出[13-14]。此次在福建省Pittii不动杆菌中同时检出NDM-1和OXA-58-like基因、在鲍曼不动杆菌中同时检出NDM-1和OXA-23-like基因应引起院感部门足够的重视。

目前对于外膜孔蛋白与外排泵在不动杆菌耐药中所起作用的研究相对较少。与不动杆菌耐碳青霉烯类抗菌药物有关的的外膜孔蛋白主要有CarO蛋白和OprD蛋白。外膜孔蛋白缺失或表达量不足，外膜通透性降低，导致抗菌药物无法进入细菌体内或进入减少，药物达不到有效浓度，从而产生耐药。OprD蛋白缺失引起菌株对碳青霉烯类抗菌药物耐药，在铜绿假单胞菌中较为常见，在不动杆菌中研究较少。外排泵系统(包括AdeABC，AdeFGH和AdeIJK等)也是引起鲍曼不动杆菌多重耐药的重要因素之一[15]。而目前发现与耐碳青霉烯类抗菌药物有关的外排泵主要是耐药结节细胞分化超家族的AdeABC和AdeIJK。AdeABC的结构基因片段主要为adeB，其表达受上游的adeRS双组分系统调节。自然状态下adeB基因不表达或者表达量极低，只有通过adeRS调控系统使该基因过度表达才能发挥外排泵的主动外排作用。本次实验结果显示，10株不动杆菌的adeRS调控系统的adeS调节基因均为阴性，因此可认为10株不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药可能与AdeABC外排泵无关。AdeIJK的结构基因片段主要为adeI,adeJ和adeK，目前在它们附近并未找到调控系统，因此其表达可能并不受特定基因调节。5株Pittii不动杆菌的carO基因均为阴性，oprD基因与AdeIJK外排泵基因大多为阳性，推测在5株Pittii不动杆菌中CarO缺失，AdeIJK外排泵的表达是导致对碳青霉烯类抗菌药物耐药的原因之一。而3株Nosocomialis不动杆菌和1株鲍曼不动杆菌外膜孔蛋白基因及AdeIJK外排泵基因均阳性，推测以上细菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药可能是AdeIJK外排泵和NDM-1共同作用的结果。

目前，用于不动杆菌的分型方法较多，脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)是公认的微生物分子分型方法的金标准，但其操作相对复杂且所需时间长，不大适用于实时评估疫情。本研究采用的是基于REP-PCR的DiversiLab分型系统，具有操作简单、重复性好、分型结果与PFGE有较好一致性，且能快速检测和实时检测等优点，是较为理想的细菌分型方法。本研究对10株不动杆菌进行分型，2株携带NDM-1型基因的鲍曼不动杆菌之间同源性差，与国内外学者报道的常见的CRAB分型结果及携带NDM-1型基因鲍曼不动杆菌的分型结果不同[16]，提示此2株携带NDM-1的鲍曼不动杆菌与其他地区CRAB流行的型别不同，可能是散发感染，但由于分析的菌株数量过少，具体机制有待进一步研究。5株Pittii不动杆菌分为两型(A和B型)，经查相关临床资料，其中3例B型患者在住院时间上有交叉，存在病区间相互交叉感染的可能。3株Nosocomialis不动杆菌虽然均来自血液科，但分为两型，其中2例A型(菌株编号为A607和615)患者都是血液科长期住院患者，且共同住院时间达6个月以上，提示存在病区内的交叉感染。另一例血液科患者感染的Nosocomialis不动杆菌为B型，提示同一病区内可能存在不同的感染源，此结果也说明DiversiLab分型系统是一个有效的分型系统，可以很容易判断菌种的同源性。可见在医院内甚至在福建省内建立不动杆菌监测平台，创建相应数据库，掌握不动杆菌的流行趋势，可为预防耐碳青酶烯类不动杆菌的流行并及早采取有效措施提供坚实的基础。基于福建省内出现同时携带NDM-1基因和OXA基因的不动杆菌，应规范各种医疗操作以及对医疗器械的消毒，同时应合理使用抗菌药物并加强院内感染的宣传和教育工作，努力健全和完善医院感染监控与管理体系。

本研究的不足之处在于不动杆菌NDM-1阳性率较低，收集的菌种偏少，笔者将在以后的研究中扩大样本量，以期进一步全面了解福建省携带NDM-1不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制。