不同糖源发酵青梅酒的理化特征和抗氧化性分析

高 璐 何怡雯 韩雪源

(绍兴文理学院 生命科学学院，浙江 绍兴 312000)

0 引言

青梅，又称为酸梅、果梅，是我国亚热带特产水果，主要种植于广东、福建和浙江等地.青梅果实清脆爽口，含多种营养物质，不仅含有对人体有益的维生素、氨基酸、有机酸，还含有钾、铁、钙等多种矿物质元素[1].在药用价值方面，青梅备受瞩目，《神农本草》中记载：梅性味甘平，可入肝、脾、肺、大肠，有收敛生津作用.

青梅酒作为青梅的主要产品，发展历史悠久，底蕴深厚.根据制作工艺不同，分为浸泡青梅酒和发酵青梅酒.浸泡型主要采用白酒或者黄酒浸泡新鲜青梅果而制得，也可以用青梅汁与白酒勾兑而成，发酵型主要利用青梅汁或者果实发酵而制得.生产中，多数选用浸泡法来酿造青梅酒，而大多数发酵青梅酒仍处于试验阶段[2]，但浸泡酒由于杂醇油浓度较高、口感粗糙、气味刺鼻，不适合直接饮用[3].与浸泡相比，发酵将促进原材料功能成分的溶解，促进生物活性成分(色氨酸、褪黑素、酪醇、谷胱甘肽和羟酪醇)的合成和释放，使之更具有生物可吸收性[4]，而微生物的代谢将积累广泛的风味化合物，包括醇类、酯类、萜烯类、醛类、有机酸和呋喃等[5-7].因此，发酵青梅酒不仅具有更好的感官特性，而且营养价值也有所提高.

青梅果含有大量的维生素、类黄酮和酚类等功能成分，但是有机酸含量较高，果味偏酸，原料在加工制作过程中受到限制.许多因素影响发酵果酒质量，如原料、醇母菌种和发酵条件等[8].本研究中，采用降酸酵母(Saccharomycescerevisiae，Lalvin71B)进行发酵，以期降低果酒酸度.众所周知，糯米作为黄酒发酵的主要原料，在糖化过程中会释放大量的单糖以及生物活性物质，为改善青梅酒的口感和品质，本研究尝试采用糯米代替蔗糖作为碳源来发酵制作青梅酒.对蔗糖和糯米两种不同的糖源发酵而成的青梅酒进行理化性质的对比和抗氧化性的分析，为生产口感饱满，香味浓郁并且营养丰富的青梅酒开辟蹊径.

1 材料与方法

1.1 青梅汁压榨

于绍兴王坛东村，选取成熟度一致，大小基本一致，无病虫害、无损伤的青梅果实，将青梅果洗净后置于-20 ℃冷冻48 h，然后在室温下解冻，直至中心温度为0 ℃.再将解冻后的青梅果放入螺旋榨汁机，经过二次压榨后收集果汁.

1.2 发酵

1.2.1 糯米青梅酒(RGW)

将1.25 L青梅果汁、1.25 L蒸馏水、1.5 kg熟糯米、3.0 g糖化酶和0.25 g乳酸链球菌素，以及0.6 g活化的降酸酵母(Saccharomycescerevisiae， Lalvin71B)(约占0.6 g/kg生糯米)加入5.0 L的发酵容器中，环境温度保持在22 ± 1 ℃.发酵期间，每天用Erma手持折射仪测定白利糖度(°Brix)，在发酵第10天，白利糖度基本稳定.于16 ℃进行后发酵.后发酵完成，将酒样进行压榨澄清.

1.2.2 蔗糖青梅酒(SGW)

用蔗糖(0.85 kg)代替RGW中的糯米，其余发酵条件与RGW相同.

1.3 理化指标测定

1.3.1 酒精度

采用蒸馏法测定.量取一定量的待测液加入Gibertini DEEPV(Super DEE， GIBERTINI， 意大利)蒸馏仪器中，蒸馏后定容，再使用Gibertini Densimat/Alcomat2 (AlcoMat-2， GIBERTINI， 意大利)酒精度测试仪，即可测得酒精度.

1.3.2 可溶性固形物含量

采用手持折光仪测定.对手持折光仪进行校准后，取待测酒样数滴置于检测棱镜上，转动目镜调节手轮，使视场的蓝白分界线清晰，分界线的刻度值即为溶液的可溶性固形物含量.

1.3.3 总酸含量

参照国标[9]，采用酸碱滴定法，结果以酒石酸当量表示.

1.3.4 总糖含量

参照国标[10]，采用斐林试剂方法，以葡萄糖溶液制作标准曲线.

1.3.5 总蛋白含量

采用Bradford法[11]，以牛血清白蛋白(BSA)为标准.考马斯亮蓝 G-250染料试剂与蛋白质结合，呈现蓝黑色，在595 nm处测得吸光度.

1.3.6 抗坏血酸含量测定

参照2，6 -二氯酚靛酚钠滴定法[12].移取0.1 mL青梅酒于10 mL容量瓶中，加入0.5 mL的偏磷酸乙酸，以及0.5 mol/L磷酸二氢钾溶液约5 mL稀释至刻度，然后充分摇匀，于70 ℃水浴反应30 min，避光2 h后，再加入5 mL的邻苯二胺，振动摇匀.在紫外波长420 nm处测定吸光度.通过抗坏血酸标准曲线计算样品中其含量.

1.4 总酚含量测定

采用福林酚法[13]进行测定.取酒样0.5 mL到加塞比色管中，加入稀释了10倍的福林酚试剂2.5 mL，静置5 min后再加入7.5%(w/v)Na2CO3溶液2 mL，加盖混匀，于50 ℃水浴反应5 min.在760 nm处测定溶液的吸光度.以没食子酸溶液制作标准曲线，结果以没食子酸当量表示(GAE)/mL酒样.

1.5 总黄酮含量测定

参照李淑珍等[14]方法进行测定，并稍作调整.取1 mL酒样于10 mL比色管中，加入1%AlCl3溶液4 mL，用无水乙醇定容至10 mL，充分摇匀，于40 ℃水浴反应60 min，在284 nm处测得吸光度.以芦丁标准溶液制作标准曲线，结果以芦丁当量表示(RE)/mL酒样.

1.6 挥发性化合物分析

通过FlavourSpec©静态顶空(SHS)气相色谱-离子迁移谱(GC-IMS)设备(Gesellschaft für Analytische Sensorsysteme mbH (G.A.S.)， Dortmund， 德国)对酒样挥发性化合物进行分析.设备配置自动进样器(PAL RSI， CTC Analytics AG， Zwingen， 瑞士).色谱柱为MXT-WAX 毛细管柱(30 m × 0.53 mm ID， 1 μm)(CS-Chromatographie Service GmbH， Düren， 德国).采用不分流进样模式.在60 ℃下，于顶空瓶中孵育酒样(1 mL)10 min.详细分析参数如下：总分析时间30 min，柱温60 ℃，载气N2，IMS温度45 ℃，进样体积100 μL，进样口温度85 ℃.详细的化合物离子化和漂移程序参数同Li等[15].

在阳离子模式下，对IMS数据进行采集，通过LAV©软件(G.A.S.)进行数据分析，包括Reporter， Gallery绘图和动态PCA插件.并通过GC-IMS Library Search©软件(G.A.S.)对化合物进行鉴定，包括NIST和IMS数据库.此外，通过一个3D地形图展示化合物在GC柱和IMS漂移管中的双重分离，其中每个特征峰均由保留时间、漂移时间和峰强度值来定义.

1.7 DPPH自由基清除能力测定

参照Brand-Williams等[16]的方法，并稍作调整.用95%的乙醇配制浓度为0.1 mmol/L的DPPH醇溶液.酒样稀释10倍待用.于比色管中加入2 mL DPPH醇溶液，2 mL稀释的青梅酒样，摇匀，室温下于黑暗环境内放置30 min.取出后于517 nm处测量吸光度(AS).用95%乙醇取代DPPH醇溶液，重复操作，测得对照样的吸光度(A0).用蒸馏水代替青梅酒样，重复操作，测得空白样的吸光度(Ab).并以抗坏血酸标准溶液的自由基清除能力为参照.DPPH自由基清除率按以下公式计算：

DPPH自由基清除率(%)

=[1-(AS-A0)/Ab]×100

式中，AS，酒样和DPPH溶液的吸光度；A0，95%乙醇和酒样的吸光度；Ab，蒸馏水和DPPH溶液的吸光度.

1.8 ABTS+ 自由基清除能力测定

参照Re等[17]，应用改进的ABTS阳离子自由基脱色法，并稍作调整. 将88 μL 140 mmol/L过硫酸钾溶液加入到5 mL 7 mmol/L ABTS+溶液中，混匀，于室温避光条件下静置12 h，制得ABTS+·储备液.储备液不能直接使用，在使用前需用无水乙醇将储备液稀释成工作液，确保工作液在734 nm处的吸光度为0.70±0.02.于比色管中加入2 mL ABTS+·工作液，以及2 mL稀释青梅酒样，混匀，室温下于黑暗环境内放置10 min.取出后于734 nm处测量吸光度(AS).用无水乙醇代替ABTS+·溶液，重复操作，测得对照样的吸光度(A0).用蒸馏水代替青梅酒样，重复操作，测得空白样的吸光度(Ab).并以抗坏血酸标准溶液的自由基清除能力为参照.ABTS+自由基清除率按如下公式计算：

ABTS+·清除率/%=[1-(AS-A0)/Ab]×100

式中，AS为酒样和ABTS+·溶液的吸光度；A0为无水乙醇和酒样的吸光度；Ab为蒸馏水和ABTS+·溶液的吸光度.

1.9 总抗氧化能力测定

参照总抗氧化能力测定试剂盒(T-AOC)(南京建城生物工程研究所，南京，中国)说明书进行.于520 nm处测定吸光度值，总抗氧化能力按如下公式计算：

式中，ODM为测量管的吸光度；ODC为对照管的吸光性；N为反应液稀释倍数(反应溶液总体积/采样量)；n为样品测试前稀释倍数.

1.10 感官评价

由10名经验丰富的品评员(5名女性和5名男性)从外观(颜色和浑浊度)、香气(酒精、水果和谷物)、口味/味道(甜、酸、苦)和口感(涩味、延续感和饱满感)等方面对酒样的感官特征进行评价.所有样本被放置在20 ± 1 ℃的感官评价室中，单独并随机地呈现给品评员.酒样放置于不透明的一次性塑料杯中，每个样品重复评价三次.每个感官的描述进行强度量化，评级从0到9(0：无；1-2：很差；3-4：较差；5-6：中等；7-8：良好；9：优秀)[18].此外，根据ISO标准，采用100分评价法，进行评价总得分计算，其中颜色(5分)、透明度(5分)、香气(30分)、味道(40分)和典型(20分)[19].

1.11 统计分析

所有试验至少进行三次生物学重复.数据用平均值加上或减去标准差(±SD)表示.采用SPSS 20.0软件进行最小显著性差异(LSD)检验，p值小于0.05或0.01，分别用“*” 或“**”表示差异显著性.

2 结果与讨论

2.1 青梅酒基本理化指标

青梅作为果酒酿造原料，具有独特风味.青梅酒营养价值高，含有丰富的有机酸、矿物质、酚类、氨基酸等[20]，而且功效良多，具有潜在的健康益处[21]，如抗癌和抗氧化性等[22]，使它成为一种很受欢迎的果酒.本研究以蔗糖和糯米为碳源，结合青梅汁发酵，得到两种干型青梅酒(总糖含量<15 g/L， 酒精度>8.0%)，其可溶性固形物含量较低，口感都较清爽.但两种青梅酒在总糖、总酸、酒精含量、总蛋白和抗坏血酸含量等指标都存在差异.SGW和RGW具体理化指标的分析比较详见表1.糯米作为中国黄酒发酵的主要原料之一，其糖化过程中能够产生大量的单糖，并将许多生物活性成分释放到发酵液中[23].以糯米为原料发酵生产的青梅酒，其总酸、可溶性固形物和总糖含量略低.而其酒精含量、抗坏血酸含量和总蛋白含量较高.总酸含量在一定程度上反映了果酒的品质，是果酒最重要的质量指标之一.总酸含量对发酵产品的风味和香气有重要影响，其含量可作为货架期的指标[24].然而，即使应用降酸酵母，由于青梅汁含酸量较高，两种酒样的总酸含量都较高.

表1 青梅酒理化性质

2.2 总酚和总黄酮含量

为进一步评价青梅酒的功能价值，对酒样的总酚和黄酮类化合物含量进行比较.以没食子酸和芦丁作为标准物，分别得到标准曲线.结果显示(图1)，蔗糖发酵的青梅酒，其总酚和黄酮类化合物含量均显著高于糯米发酵的青梅酒.其中，RGW的总酚含量为23.15±1.7 mg GAE/L，SGW的总酚含量为33.89±3.56 mg GAE/L.并且，在总黄酮含量分析中，两种青梅酒呈现出极显著差异.据报道，酚类和黄酮类物质具有很高的抗氧化活性和多种健康益处[25].

图1 青梅酒样中总酚和总黄酮含量(LSD显著性差异分析，p = 0.05)

2.3 挥发性化合物分析

香气物质是酒类产品的重要特征指标.通过GC-IMS技术分析比较两种青梅酒的挥发性化合物成分.GC-IMS技术结合了气相色谱的高分离效率和离子迁移谱的快速响应、高灵敏度，具有无样品预处理(无损)、简单、快速、准确等优点，特别适用于挥发性有机化合物的分析.结果如图2，以一个3D地形图反映化合物数据，其中z轴为用于定量的峰强度，y轴和x轴分别为气相色谱分离保留时间和离子迁移时间.图2表明，两种青梅酒的挥发性化合物成分基本相似，但是在化合物峰强度和个别挥发性成分上存在差异.

图2 酒样GC-IMS分析3D地形图

为进一步比较分析，得到3D地形图的俯视图(图3)，并对反应离子峰和迁移时间进行归一化处理，图中每一个点代表一种挥发性化合物.大部分信号出现在保留时间100～120 0 s和相对漂移时间1.0～2.0范围内.图中颜色代表化合物的信号强度，颜色越深，强度就越强.红色表示高信号强度，白色表示低信号强度.两种青梅酒中共检测出44种挥发性化合物，其中通过GC-IMS库检索，成功鉴定出26种挥发性化合物，包括10种酯类化合物，见图3和表2.某些化合物由于其浓度不同而产生多个斑点或信号(单体或二聚体).酯类、醇类和醛类是青梅酒中主要的挥发性化合物，但它们的浓度因发酵糖源的不同而明显不同.

图3 3D地形图的俯视图(数字代表被成功鉴定的化合物；A，SGW;B，RGW)

表2 挥发性化合物的GC-IMS综合参数

为更直接地比较两种青梅酒中挥发性化合物的差异，利用化合物指纹图谱(见图4)对青梅酒进行定性定量表征.其中，正己醇和苯甲醛仅在RGW中检测到.苯甲醛是青梅酒的典型香气物质[26].据报道，以苦荞麦(Fagopyrumtataricum)代替糯米为原料，黄酒的风味物质将被显著影响[27].本研究中，RGW中的2-庚醇、庚醇、1-戊醇、丙二酮、乙酸丁酯和2-甲基丙酯的含量高于SGW.与RGW相比，SGW中乙酸、辛酸乙酯、乙酸丙酯和丁酸乙酯的含量较高.总体而言，以糯米发酵的青梅酒中酯类和醇类的含量高于以蔗糖发酵的青梅酒.酯类一方面来源于醇和脂肪酸的酯化，另一方面来源于微生物的合成代谢[28].以上结果表明，RGW比SGW具有更丰富的挥发性物质和较好的整体风味协调性.

图4 挥发性化合物信号峰指纹图

2.4 自由基清除和总抗氧化能力

为进一步评价两种青梅酒的潜在抗氧化性能，以不同浓度Vc为参照，比较分析酒样DPPH自由基清除能力.得到Vc浓度和清除率标曲为y=11.741x+0.1853(R2=0.998 9).青梅酒样DPPH自由基清除率结果显示(图5)，SGW的清除能力极显著强于RGW. 其中， RGW的DPPH自由基清除率为66.25±1.94%(Vc当量5.63 μg/mL)，SGW的DPPH自由基清除率为82.86±0.188%(Vc当量7.04 μg/mL).

图5 自由基清除率和总抗氧化性

以不同浓度Vc为参照，比较分析两种青梅酒的ABTS+自由基清除能力.得到Vc浓度和清除率标曲为y=20.857x+4.45(R2=0.998 5).结果与DPPH·不同，RGW的ABTS+自由基清除率为35.92±0.56%(Vc当量1.51 μg/mL)，SGW的ABTS+自由基清除率为27.87±0.61%(Vc当量1.12 μg/mL).前者的清除能力强于后者，并且两者呈现极显著差异(图5).

以铁离子还原能力为基础，应用试剂盒，比较分析两种青梅酒的总抗氧化能力.结果如图5，SGW的总抗氧化能力(56.40±4.41 U/mL)显著强于RGW(47.91±3.64 U/mL).与DPPH·清除能力一致，蔗糖发酵的SGW具有更强的抗氧化能力.这与SGW的总酚和总黄酮含量高于RGW相对应.

2.5 感官评价

从表观、香气、味道和典型性等方面对青梅酒进行感官评价.如图6，RGW色泽明亮，酒体澄清，醇香饱满，并带有谷物香，味道浓郁，酒体协调.然而，SGW色泽偏暗，底部略有沉淀，其酸涩味明显，后味较苦，整体协调性较差.在百分制总体评价中，SGW得分为74.50±3.33，RGW得分为84.50±3.0.在酒类感官评价中，一般认为80分以上的样本为可接受、良好样本，70～80分之间的样本一般为可接受样本，70分以下的样本为不可接受样本.

图6 青梅酒感官评价

3 结论

本试验通过研究不同发酵糖源对青梅酒理化特征和抗氧化成分的影响，对青梅酒的各项品质指标进行系统的测定分析.结果表明，RGW的酒精含量、抗坏血酸含量和总蛋白含量高于SGW.但在功能成分方面，SGW中总酚和类黄酮含量较高，其抗氧化能力也略高于RGW.香气成分分析显示，RGW比SGW具有更丰富的挥发性物质和较好的整体风味协调性.感官评价方面，RGW在外观、香气、味道和典型性方面优于SGW，有较高的感官评分.综合考虑以上结果，认为以糯米为糖源发酵的青梅酒更能够提高发酵青梅酒的品质.