尖吻鲈幼鱼运输密度和时长对运输水质及其复苏率和抗氧化能力的影响

陈 旭 ，左 涛 ，周胜杰 ，杨 蕊 ，于 刚 ，秦传新 ，马振华

（1. 中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心/三亚热带水产研究院，海南 三亚 572018；2. 农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东 广州 510300）

鱼类是一种低等水生脊椎动物，很容易受外界环境影响。在水产养殖生产管理过程中换水、吸污、拉网、捕捉、离水、运输等环节，常会对鱼体造成一定胁迫[1-3]。尤其在运输过程中由于运输水体污染、机械振动、包装密度过高、温度变化、运输时间过长以及搬运造成的颠簸会引起鱼苗的应激反应[4-6]。这种反应会扰乱鱼苗的一些正常生理反应，导致鱼苗氧化应激、细胞凋亡、免疫力下降，甚至死亡。

鱼苗运输在水产养殖生产中应用十分广泛，如何提高鱼苗运输成活率是目前研究的重点之一。密闭充氧运输方式具有用水量少、成活率高等优点受到国内外学者关注。关于鱼苗密闭充氧运输相关方面的研究，主要集中在运输过程中和运输后对水质和鱼苗生理生化的影响，以求获得最适宜的运输密度和运输时长。如研究杂交海鲤 (Pagrus major♀×Acanthopagrus schlegelii♂)[7]幼鱼和卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)[8]鱼苗不同运输密度对运输水质和生理生化的影响；黑鲷 (Sparus inacrocephalus)[9]鱼苗最适宜运输密度及运输后生理生化变化情况；翘嘴鲌 (Culter alburnus)[10]稚鱼运输时间和MS-222浓度对翘嘴鲌全鱼皮质醇、乳酸含量及氧气袋内水质的影响等。尖吻鲈 (Lates calcarifer)，俗称盲，隶属于鲈形目、鲈亚目、尖吻鲈科、尖吻鲈属[11-12]。由于鱼肉品质好、生长速度快、抗逆强、营养价值高，广受消费者喜爱。目前，随着尖吻鲈养殖业的不断发展，对其鱼苗的需求量越来越大，鱼苗运输也日渐频繁，因此探明尖吻鲈幼鱼运输密度和时长对运输水质及其复苏率和抗氧化能力的影响，保证运输过程中鱼苗的质量显得非常重要。目前有关尖吻鲈鱼苗胁迫应激方面的研究较少。本试验采用塑料袋密闭充氧保活运输的方法，探究在不同密度和不同时长运输胁迫下，对尖吻鲈幼鱼运输水质、复苏率以及全鱼组织中抗氧化能力的影响。了解尖吻鲈幼鱼应激程度的大小，设定最优的尖吻鲈幼鱼运输密度和时长，以便提供更科学的运输方法，减少运输过程中对尖吻鲈幼鱼的伤害。

1 材料与方法

1.1 试验材料

尖吻鲈幼鱼由中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心自行培养，选取体质健康、体表无伤、活力强且规格相近的尖吻鲈幼鱼作为试验用鱼。试验用幼鱼平均体长为 (1.42±0.19) cm，平均体质量为 (0.06±0.02) g，运输试验开始前24 h禁食。总超氧化物歧化酶 (TSOD)、过氧化物酶 (POD)、丙二醛 (MDA) 试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。试验用水为经过沙滤后的自然海水。

1.2 模拟运输试验方法

设置 3 种运输密度 (D1=14 kg·m−3、D2=21 kg·m−3、D3=28 kg·m−3)，然后模拟运输24 h；同时在运输密度7 kg·m−3[13]下模拟 6 个不同运输时长 (T1=4 h、T2=8 h、T3=12 h、T4=16 h、T5=20 h、T6=24 h)；每个试验组设3个平行，对照组为正常养殖的尖吻鲈幼鱼。试验用塑料袋尺寸为48.0 cm×37.0 cm×22.5 cm，每袋注入海水4.5 L，每袋放入相应数量的尖吻鲈幼鱼。然后把袋里的空气排空，注入纯氧，体积约为9 L。充氧完毕后快速使用橡皮筋系紧，置于事先设置好温度 (24.0 ℃) 的空调房泡沫箱上。试验期间禁止打开塑料袋，每隔1 h晃动塑料袋10次以便氧气和海水充分混匀。按照试验要求取完样后，把塑料袋内剩余的幼鱼放入循环水系统内 (水温24.1 ℃，盐度32，pH 7.92) 进行养殖，期间正常曝气、投喂，7 d后记录剩余幼鱼存活情况。

1.3 样品采集与检测分析

在不同运输密度试验中，试验开始前和试验结束后以及在不同运输时长试验中，分别在第0、第4、第8、第12、第16、第20、第24小时用500 mL取样瓶取试验水样。用HACH多探头水质测定仪 (HQ40d, HACH) 深入塑料袋中测定其水温 (℃)、酸碱度 (pH)、溶解氧 (DO)。根据中华人民共和国国家标准海洋调查规范第四部分：海水化学要素调查 (GB/T 12763.4—2007)，采用次溴酸钠氧化法测定水体中氨氮 (-N) 含量，采用重氮-偶氮法测定水体中亚硝态氮 (-N) 含量。采集20尾全鱼，分装为两管后立刻放置于−80 ℃冻存备用。样品分析前于4 ℃冰箱中解冻，用DREAMEL研磨仪研磨，后放入EXPERT 18K-R冷冻离心机，在4 ℃下，2 500 r·min−1离心10 min，取上清液用于T-SOD和POD活性以及MDA含量的测定。后续的操作详见南京建成生物工程研究所研发的试剂盒使用说明书，在多功能酶标仪 (美国伯腾Biotek Synergy H1) 中测定吸光值，换算成相应浓度或酶活值。

1.4 统计分析

试验数据利用SPSS 19.0和Excel 2016软件进行统计分析与作图并进行单因素方差分析 (One-way ANOVA)，各试验组间存在差异用Duncan's多重比较，当P＜0.05时为差异显著，结果以“平均值±标准差 (X ±SD )”表示。

2 结果

2.1 密度运输后水质、复苏率和7 d后成活率的变化

尖吻鲈幼鱼运输24 h后，运输塑料袋内水温约为(24.1±0.25) ℃；D2和D3组组间水体pH和DO差异不显著，均显著低于D1组 (P＜0.05，图1-a、1-b)；水体中各密度组组间-N和-N差异均显著 (P＜0.05)，均是D3组＞D2组＞D1组 (图1-c、1-d)；运输24 h后D1组尖吻鲈幼鱼复苏率显著高于D2和D3组 (P＜0.05)，D2和D3组差异不显著 (图1-e)。

图1 不同运输密度对尖吻鲈幼鱼运输水质和复苏率的影响不同字母表示数据间有显著性差异 (P＜0.05)；后图同此Figure 1 Effect of different transport density on transport water quality and resuscitation rate of juvenile L. calcariferValues with different superscripts are significantly different (P＜0.05); the same case in the following figures.

2.2 时长运输后运输水质、复苏率和7 d后成活率的变化

尖吻鲈幼鱼运输过程中，运输塑料袋内水温约为(24±0.12) ℃；T1组和T2组相比，pH差异不显著，均显著高于 T3、T4、T5、T6 组 (P＜0.05)，T3、T4、T5、T6 组组间差异不显著 (图2-a)；水体中DO均超出仪器测量范围(≥21.98 mg·L−1)；水体中-N 和-N 各组组间差异均显著，并随着运输时长的增加均显著升高 (图2-b、 2-c)；各试验组组间尖吻鲈幼鱼复苏率差异均不显著 (P＞0.05)，其中T1、T2、T3和T5组复苏率均为100%，T4和T6组复苏率分别为98.72%和99.62%；同时，运输密度和运输时长试验结束后剩余幼鱼在循环水系统内养殖7 d，成活率均为100%。

图2 不同运输时长对尖吻鲈幼鱼运输水质的影响Figure 2 Effect of different transport duration on transport water quality of juvenile L. calcarifer

2.3 密度运输后全鱼组织T-SOD、POD活性及MDA含量的变化

不同运输密度试验中，对照组尖吻鲈幼鱼T-SOD活性最高，与D3组相比差异不显著，均显著高于D1和D2组(P＜0.05)；D1、D2和D3组组间差异均不显著 (P＞0.05，图3-a)。D1、D2和对照组组间POD活性差异均不显著，均显著高于D3组 (P＜0.05，图3-b)。D2与D3组组间MDA含量差异不显著，均显著高于D1和对照组 (P＜0.05)，D1与对照组相比差异不显著 (图3-c)。

2.4 时长运输后全鱼组织T-SOD、POD活性及MDA含量的变化

不同运输时长试验中，随着运输时间的增加尖吻鲈全鱼组织中的T-SOD活性总体呈升高−降低−升高的变化趋势。T3组T-SOD活性最高，与T4组相比差异不显著，显著高于其他各组 (P＜0.05)；T4组T-SOD活性显著高于T1、T2、T5和对照组 (P＜0.05)；T6组T-SOD活性显著高于T1、T2和对照组 (P＜0.05)；T1、T2、T5和对照组组间T-SOD活性差异均不显著 (P＞0.05，图3-d)。随着运输时间的增加尖吻鲈幼鱼全鱼组织中的POD活性总体呈升高−降低−升高−降低的不规则变化。各试验组POD活性均显著高于对照组 (P＜0.05)；T3组POD活性最高，显著高于其他各组 (P＜0.05)；T2组POD活性显著低于T1、T4、T5组；T1、T4、T5、T6组组间POD活性差异均不显著 (图3-e)。随着运输时间的增加尖吻鲈全鱼组织中MDA含量总体呈现升高−降低−升高−降低的不规则变化。T2组MDA含量最高，与T4组相比差异不显著，显著高于T1、T3、T5、T6和对照组 (P＜0.05)；除了T2组，各组组间MDA含量差异均不显著 (P＞0.05，图3-f)。

图3 不同运输密度和运输时长对尖吻鲈幼鱼总超氧化物歧化酶、过氧化物酶活性及丙二醛质量摩尔浓度的影响Figure 3 Effect of transportation density and duration on T-SOD, POD activity and MDA content of juvenile L. calcarifer

3 讨论

3.1 不同运输密度和运输时长对尖吻鲈幼鱼运输水质、复苏率和7 d后成活率的影响

密封充氧将鱼类限制在一个充氧后密封小水体中，然后进行高密度和长时间的一种运输方法。运输水质的恶化很大程度上受到运输密度、鱼的规格以及运输时间的影响，而运输水质的变化对于鱼苗存活、保活时间、鱼苗体质健康等至关重要[14-17]。研究表明，密封充氧运输黑尾近红鲌 (Ancherythroculter nigrocauda)[18]仔稚鱼、翘嘴鲌[19]稚鱼和卵形鲳鲹[13]鱼苗等过程中，随着运输密度和时间的增加，-N升高而DO和pH降低，这些研究结果与本试验相一致。本试验在开始前水体清澈见底，随着运输密度和时间的增加水体逐渐变混浊，水体中-N和-N升高而DO、pH和复苏率降低。这说明在运输密度和时长胁迫下，尖吻鲈幼鱼代谢速率明显加快，引起耗氧率、CO2和代谢废物排泄量的增加，造成运输水体中-N和-N升高。幼鱼复苏率降低是由于CO2溶于水中导致pH降低，进一步增加应激反应和-N与-N浓度过高造成幼鱼鳃部损害、鱼体中毒以及死亡。剩余鱼体正常养殖7 d后成活率均为100%，表明在本试验条件下，运输密度和时长胁迫对尖吻鲈幼鱼机体产生的影响，在鱼体复苏恢复后对养殖成活率没有影响。本试验中不同的是，运输时长试验中各组DO均超出仪器测量范围(≥21.98 mg·L−1)，可能原因是鱼苗的呼吸、排泄物以及分泌的体液等造成的耗氧量远低于充入的纯氧量。

3.2 不同运输密度对尖吻鲈幼鱼抗氧化能力的影响

鱼类受到外界环境刺激时，其非特异性免疫系统在应对逆环境应激时起主导作用，其中T-SOD、POD和过氧化脂质及其产物MDA等物质在免疫调节过程中扮演着重要角色。这些物质不但可作为判断鱼类的生长、健康状况以及赖以生存的环境状况的依据，还可用作氧化应激水平的量化指标[20-21]。研究表明，密封充氧运输卵形鲳鲹鱼苗8 h后，随着运输密度的增加，肝脏POD活性逐渐下降，但高于对照组[8]。团头鲂 (Megalobrama amblyocephala) 随着饲养密度的增加，其肝脏SOD活性显著下降，而MDA含量显著增加[22]。黑鲷 (Sparus inacrocephalus) 密封充氧运输后，10尾组和15尾组血清和肌肉中的MDA含量显著低于30尾组，而SOD活性显著高于30尾组[9]，与本试验结果相似。在鱼类正常的生命活动中，有机体内的氧自由基(ROS) 处于一种不断地产生，又不断地被清除的动态平衡状态[23]。本试验中运输密度对尖吻鲈幼鱼全鱼组织TSOD活性影响不显著。这表明机体非特异性免疫系统产生的T-SOD可以清除体内由运输密度胁迫产生的多余ROS，维持尖吻鲈幼鱼体内ROS的动态平衡。随着运输密度的增加，迫使机体通过非特异性免疫系统代谢调节来清除胁迫所产生的过多ROS，消耗了大量的POD，造成POD活性降低；而MDA含量的升高是由于尖吻鲈幼鱼体内的非特异性免疫系统对运输密度做出反应，清除过多ROS以减轻运输密度胁迫对机体造成的损伤。

3.3 不同运输时长对尖吻鲈鱼幼鱼抗氧化能力的影响

机体受到外界环境刺激时，通过氧化还原反应进行多层次应激性调节和信号转导，以消除体内过多ROS[24-26]。应激条件下，SOD将机体内产生的ROS分解成过氧化氢(H2O2)，而CAT又可以将H2O2还原成氧分子 (O2) 和水(H2O)，从而消除ROS对机体的影响[27-28]。POD具有消除H2O2和酚类、胺类、醛类、苯类毒性的双重作用[29]。MDA是生物体脂质氧化的天然产物，可以间接反映机体抗氧化能力的强弱[30-31]。研究表明，操作胁迫 (惊扰) 下云纹石斑鱼 (Epinephelus moara) 肝脏SOD活性随着处理时间的延长先升高后降低[32]。急性拥挤胁迫后，半滑舌鳎 (Cynoglossus semilaevis) MDA含量呈升高−降低−升高的变化[25]。运输后黄颡鱼 (Pelteobagrus fulvidraco) 血清 SOD活性显著升高，随着恢复时间的推移逐渐回降到正常水平；但POD活性未出现显著差异[33]，这与本试验相似。本试验中在不同运输时长胁迫下，尖吻鲈幼鱼全鱼组织中的TSOD和POD活性随着运输时间的增加总体呈先升高后降低的变化趋势，表明其受运输时长胁迫产生了大量ROS，机体抗氧化防御体系作出反应，导致机体T-SOD和POD活性升高，以清除过量ROS使机体免遭氧化损伤。随着运输时间的继续增加，T-SOD和POD活性降低，说明长时间的运输胁迫产生的ROS，超过了抗氧化体系处理ROS的阈值，机体组织受到了严重损伤，导致抗氧化物质合成能力下降，抗氧化水平下降，机体正常的ROS“稳态性动态平衡”被破坏。MDA含量升高实际上反映了运输时长胁迫应激诱导机体产生了大量的ROS，导致脂质过氧化反应变强，因而脂质的过氧化物也随之增多。机体抗氧化防御体系反应导致MDA含量升高以应对抗氧化应激。MDA含量降低，表明清除过量的ROS消耗了大量的MDA或ROS，超过抗氧化体系处理的阈值，机体组织受到了严重损伤。

综上所述，为减少运输损失和运输胁迫对鱼苗生长与健康的影响。建议在水温24 ℃、盐度32、pH 7.92的条件下用塑料袋密封充氧运输1.42 cm左右的尖吻鲈幼鱼24 h时，密度不超过21 kg·m−3为宜。