分子标记鉴定与田间性状选择相结合培育水稻‘黑大香1’

李荣田，马腾旭，王皓然，刘长华,3

（1黑龙江大学生命科学学院/黑龙江省普通高等学校分子生物学重点实验室，哈尔滨150080；2黑龙江大学农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨150500；3黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨150080）

0 引言

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，世界上一半以上的人口以稻米为主食[1]。中国是世界上最大的水稻生产国，黑龙江省是中国最大的稻作区之一[2]。东北大米以其绿色优质深受消费者青睐，特别是五常‘稻花香2号’大米具有良食味、香味等特点成为世界级优质粳米[3]。不过，因为‘稻花香2号’水稻生育期长，只能在黑龙江省第1积温区上限、平原、自流灌溉区域种植，再加上其易倒伏、丰产性差、出米率低等，使得五常‘稻花香2号’大米数量少、价格高，不能满足市场需求。同时，地处黑龙江省第1积温区下限的哈尔滨市广大区域具有与五常类似的、生产顶级优质米的生态环境。缺少适应优质米生产的品种，是把哈尔滨市建设成为“中国优质稻米之都”的限制因子之一[4]。因此，培育适于黑龙江省第1积温区下限的、高产良食味品种，是十分必要的。抽穗期(Heading date，Hd)决定了水稻品种在不同区域的适应能力和产量[5]。Hd2是决定水稻抽穗期主效基因之一，定位在第7号染色体上[6]。hd2是Hd2的突变基因，hd2位点其中的一个SNP是T2129C的变化，Hd2具有XcmI酶切位点(5’-CCANNNNNNNNNTGG-3’)，hd2相应的序列(5’-CTANNNNNNNNNTGG-3’)失去了该酶切位点，据此开发了Hd2-Caps标记[7]。Hd4是另一个控制水稻抽穗期主效QTL[8]。由Hd4突变为hd4基因是在其CDS第157个碱基由G突变为T，Hd4具有XhoI酶切位点（5’-CTCGAG-3’），而hd4相应的序列(5’-CTCTAG-3’)失去了此酶切位点，依据该SNP开发了Hd4-Caps标记[7]。黑龙江省水稻晚熟品种大多数具有Hd2和Hd4基因，早熟品种具有hd2及hd4基因[9]。水稻香味主要物质是 2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline,2AP)[10]。香味主效基因Fgr/fgr位于第8号连锁群上，有Fgr基因的水稻2-AP合成受到抑制，没有香味，Fgr基因突变为fgr，促进了2-AP的合成，水稻产生香味[11]。在香稻品种中，常见的是Fgr基因的第7外显子有1个8 bp的缺失和3个单核苷酸多态性位点，依据这个特点设计了4条PCR引物的Fgr-SNP标记[12,13]。水稻‘稻花香2号’具有Hd2Hd2Hd4Hd4基因型。水稻‘空育131’是黑龙江省第3积温区品种，具有hd2hd2hd4hd4基因型。以‘稻花香2号’为受体，‘空育131’为hd2和hd4供体，利用全基因组选择技术，回交转育创制了导入系‘稻花香2号(hd2hd4)’。水稻‘吉粳88’适于吉林省北部和黑龙江省南部地区种植，具有株型直立、抗倒伏、耐冷、丰产、出米率高、米质较好等优良农艺性状[14-15]。以‘稻花香2号’为蓝本，保留其良食味、香味及粒型等基因及性状，同时利用‘空育131’早熟抽穗期基因及‘吉粳88’的优良农艺性状，对其株型、熟期、抗倒伏性、丰产性及碾磨品质等性状进行遗传改良，培育生育期较早、高产良食味品种，有利于五常式优质米生产区域扩大。为此，配制了杂交组合‘吉粳88’ב稻花香2号(hd2hd4)’，利用分子标记与田间性状选择相结合的方法培育适于黑龙江省第1积温区下限的高产良食味水稻新品种。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 水稻‘吉粳88’，‘稻花香2号(hd2hd4)’。

‘吉粳88’ב稻花香2号(hd2hd4)’的各个分离世代，以及经过鉴定选择形成的稳定品系。

‘稻花香2号’，作对照。‘蒙古稻’，稻瘟病全感品种。

1.1.2 分子标记 用于鉴定基因位点Hd2(hd2)和Hd4(hd4)以及Fgr(fgr)的功能性分子标记见表1。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。实验中所用的化学试剂和分子生物学试剂均购于生工生物工程（上海）股份有限公司。

表1 鉴定水稻Hd2(hd2)、Hd4(hd4)和Fgr(fgr)基因位点的功能性分子标记

1.2 方法

1.2.1 水稻基因组DNA提取与PCR扩增及其产物酶切 在秧苗期取水稻叶片，依据CTAB法[16]提取水稻基因组DNA，将提取后的DNA置于-20℃冰箱中保存备用。

Hd2-Caps和Hd4-Caps标记PCR反应体系20 μL：1.5 μL水稻DNA，0.5 μL正向引物(10 μmol/L)，0.5 μL反向引物(10 μmol/L)，5.15 μL Taq PCR Master Mix(0.1 U/μL Taq DNA Polymerase，2×PCR buffer，3 mmol/L MgCl2，0.4 mmol/L dNTP)，12.35 μL ddH2O。

Hd2-Caps和Hd4-Caps标记PCR反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，59℃复性30 s，72℃延伸30 s，38循环；72℃延伸10 min；4℃保存∞。

Hd2-Caps或Hd4-Caps标记酶切：PCR产物体系加入 1.0 μL cutsmart缓冲液，0.2 μL XcmI或 XhoI酶(10 U/μL)，形成酶切反应体系。酶切反应体系置于37℃酶切2 h左右。取出，电泳检测。

Fgr-SNP 标 记 PCR 反应 体系 20 μL：2 μL 水 稻DNA ，0.5 μL P1(10 μmol/L)，0.5 μL P2(10 μmol/L)，0.5 μL P3(10 μmol/L)，0.5 μL P4(10 μmol/L)，6 μL Taq PCR Master Mix(0.1 U/μL Taq DNA Polymerase，2 ×PCR buffer，3 mmol/L MgCl2，0.4 mmol/L dNTP)，10 μL ddH2O。

Fgr-SNP标记PCR反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，54℃复性30 s，72℃延伸30 s，30循环；72℃延伸10min；4℃保存∞。

利用1%琼脂糖凝胶电泳对酶切的PCR产物及PCR产物进行检测。

1.2.2 ‘黑大香1’的培育过程‘黑大香1’培育过程见图1。所有田间试验在黑龙江大学呼兰校区水稻基地和海南省三亚市南滨国营农场黑龙江大学水稻南繁基地进行。

图1 培育水稻‘黑大香1’的工作流程

1.2.3 ‘吉粳88’和‘稻花香2号(hd2hd4)’田间性状比较‘吉粳88’和‘稻花香2号(hd2hd4)’插秧栽培，各项农事操作同当地生产田。试验设计为随机区选法，3次重复，小区为3行区，行长4 m，行距30 cm，株距12 cm，小区面积4.6 m2，单本插秧。抽穗期调查茎叶株型指标和叶瘟级别，株型指标包括主茎剑叶与茎基角、张角和披垂角等3个性状，叶瘟级别根据农业行业标准《水稻品种试验稻瘟病抗性鉴定与评价技术规程》(NY/T2646-2014)进行划分。黄熟期田间调查倒伏指数，调查方法同文献[17]。室内考种调查结实率、千粒重和稻谷长宽比。每小区调查5株，以5株平均数代表小区值，以小区平均数进行方差分析及差异性比较。

1.2.4 水稻品系田间性状鉴定 水稻品系和‘稻花香2号’插秧栽培，各项农事操作同当地生产田。试验设计为随机取组法，3次重复，小区为8行区，行长5 m，行距30 cm，株距12 cm，每蔸插3棵苗，小区面积12.0 m2。生长发育期间，每个小区按对角线定点5蔸，每蔸选择1个主茎标记叶位，直至孕穗期止，根据叶位结果即知主茎叶片数。调查茎叶形态各指标同1.2.3。收获期每小区取5株进行室内考种，考种性状包括株高、穗数、穗粒数、穗实粒数、结实率、千粒重、粒长、粒宽、长宽比等。收获期每小区按对角线选2点每点收割1 m2测产，稻谷用于室内分析精米率、香味和食味值。食味值根据国家标准《粮油检验稻谷、大米蒸煮食用品质感官评价方法》(GB/T 15682-2008)进行评分。以小区平均数进行方差分析，t测验检验水稻品系与‘稻花香2号’的差异显著性。

1.2.5 ‘黑大香1’的稻瘟病抗性、耐冷性和抗倒性鉴定鉴定水稻‘黑大香1’的稻瘟病抗性、耐冷性和抗倒性，对照‘稻花香2号’。鉴定方法及试验设计同参考文献[18]和[19]。

2 结果与分析

2.1 培育水稻‘黑大香1’的选择体系

2.1.1 分子鉴定选择体系 图2显示分子标记Hd2-Caps、Hd4-Caps和Fgr-SNP在‘吉粳88’ב稻花香2号(hd2hd4)’的双亲之间有明显的多态性，母本和父本分别具有Hd2Hd2Hd4Hd4FgrFgr和hd2hd2hd4hd4fgrfgr基因型，可以用于检测基因位点Hd2(hd2)、Hd4(hd4)和Fgr(fgr)。

图2 抽穗期及香味基因分子标记在‘吉粳88’和‘稻花香2号(hd2hd4)’间的多态性

2.1.2 田间观察选择体系‘吉粳88’和‘稻花香2号(hd2hd4)’田间农艺性状见表2。由表2可见，与‘吉粳88’比较，‘稻花香2号(hd2hd4)’株型披散、易倒伏、结实性差，稻谷子粒较大、较长，有香味。据此建立了田间农艺性状选择体系：株型直立，抽穗期和黄熟期田间选择茎叶夹角小的植株；抗倒伏，黄熟期以手触摸茎基部节间，选择茎基部节间耐压力强的植株；耐冷性，黄熟期选择分蘖穗空粒少的植株；粒型，黄熟期选择稻谷大粒、长宽比高的植株。

表2 水稻‘吉粳88’和‘稻花香2号(hd2hd4)’田间农艺性状

2.2 水稻‘黑大香1’的培育

2.2.1 F1世代植株鉴定选择‘吉粳88’ב稻花香2号(hd2hd4)’的F1代。利用分子标记Hd2-Caps对F1代植株进行鉴定，结果见图3。由图3可知，在10个F1代植株中2、3、4、5、6、7、8、9号植株表现为杂合带型，是真杂种；1、10号植株是伪杂种，予以剔除。收获真杂种的种子形成F2代。

图3 水稻‘吉粳88’ב稻花香2号(hd2hd4)’的F1代植株Hd2-Caps分子表型

2.2.2 自交世代植株鉴定选择 F2世代。用F2世代种子育苗，选择健壮的秧苗至少107株，分子检测水稻秧苗。按照具有hd2、Hd4和fgr基因的原则选择秧苗。入选秧苗移植到本田，田间按着茎叶直立、抗倒伏、结实好、大长粒及生长健壮的原则初选及决选植株，收获决选的植株形成F3株系。具体见表3。

表3 水稻F2世代的分子标记及田间性状的鉴定选择

F3世代。F3世代5个株系，每个株系秧苗期分子检测17株。依据具有hd2、Hd4和fgr基因的原则选择水稻秧苗，移植至本田。本田阶段田间依据农艺性状优良且Hd2(hd2)、Hd4(hd4)和Fgr(fgr)位点目标基因尽量纯合的原则，每个株系决选1株并收获种子形成F4世代。具体见表4。

表4 水稻F3材料分子鉴定及田间选择

F4世代。与F3世代工作类似，秧苗期分子鉴定与本田阶段田间农艺性状选择相结合，每个株系决选1株，收获种子，形成F5世代。具体见表5。此外，由表5可知，F4世代决选株基因型为hd2hd2Hd4Hd4fgrfgr。

表5 水稻育种材料F4代分子鉴定及田间选择

F5世代。F5世代秧苗期各株系随机选5株提取DNA，株系内各株DNA等量混合形成混合DNA。以混合DNA为模板分子检测的基因型见图4。图4显示F5世代5个株系均为hd2hd2Hd4Hd4fgrfgr的纯系。F5世代每个株系本田插秧17株，形成株行。本田阶段田间目测选择结实好、茎叶直立、抗倒伏、大长粒的株系及其植株，每个株系选1株收获种子，形成F6世代。

图4 分子检测水稻F5世代株系Hd2(hd2)、Hd4(hd4)和Fgr(fgr)基因型

F6及其以后世代。F6世代以株系为单位育苗移栽，各个株系不少于17株。本田阶段进行农艺性状选择，各个株系决选1株，形成下一世代株系。F7及其以后世代重复F6世代工作，直至形成稳定一致株系时为止。收获株系，形成品系，即‘品系-1’、‘品系-2’、‘品系-3’、‘品系-4’和‘品系-5’。

2.3 水稻品系田间表现

水稻品系田间表现见表6。表6显示，与‘稻花香2号’比较，各品系主茎叶片数变少，茎叶直立，株高变矮，穗数变多，穗粒数变少，结实率增加，精米率提高，丰产性变好。同时各品系具有大长粒粒型，香味，以及食味优良等特征。其中，‘品系-4’综合表现最好，选择‘品系-4’并命名为‘黑大香1’。

表6 水稻品系及其对照的田间性状

2.4 ‘黑大香1’的稻瘟病抗性、耐冷性和抗倒性

水稻‘黑大香1’的稻瘟病抗性、耐冷性和抗倒伏性的鉴定结果见图5。由图5可知，‘黑大香1’与‘稻花香2号’稻瘟病叶瘟及穗颈瘟发病级别、耐冷性结实率均未见显著性差异，倒伏指数极显著地降低。说明‘黑大香1’与‘稻花香2号’比，抗稻瘟病性和耐冷性相似，抗倒伏性增强。

图5 水稻‘黑大香1’的稻瘟病抗性、耐冷性和抗倒伏性

3 讨论与结论

水稻抽穗期及香味受Hd2(hd2)、Hd4(hd4)及Fgr(fgr)位点控制。周文甲等[20]以黑龙江省第2积温区水稻品种‘绥粳14’为材料，利用CRISPR/Cas9技术对基因Hd2进行基因编辑，使Hd2基因突变为hd2，创造了早熟香味水稻‘绥粳14-d1’和‘绥粳14-d2’。薛为亚等[21]研究‘汕优63’衍生的F2群体，发现了Hd4基因的自然变异是调控水稻抽穗期和产量潜力的重要因素。桑茂鹏等[22]分子标记可以有效地从水稻育种群体中选择fgr基因及其香味性状。本研究结果证明晚熟水稻‘吉粳88’具有Hd2Hd2Hd4Hd4抽穗期基因型，早熟水稻‘稻花香2号(hd2hd4)’具有hd2hd2hd4hd4基因型，利用功能性分子标记从‘吉粳88’ב稻花香2号(hd2hd4)’组合后代中选择的具有hd2hd2Hd 4Hd4fgrfgr基因型水稻品系，植株体及稻米具有香味，主茎叶片数13片左右。

株型、粒型、抗倒伏等性状是水稻重要的农艺性状，遗传基础复杂。目前利用分子标记进行这些农艺性状的鉴定选择尚有难度。张洪熙等[23]利用田间选择方法在长江中下游稻区培育成功了籼型水稻理想株型材料。李扬等[24]依据田间目测观察结合分子标记检测，定向改良了株系‘SAGC-4’的粒长性状。王笑见等[25]利用分子标记结合田间农艺性状鉴定选择，创建了一批抗倒伏、抗稻瘟病或褐飞虱的恢复系。本研究利用田间目测观察茎叶姿态、子粒大小及形状、成熟期茎秆基部耐压能力等特征，选择出了株型直立、大长粒、抗倒伏的水稻品系。

利用分子标记与田间观察相结合鉴定选择育种材料，是创制水稻新种质、培育水稻新品种的有效方法。裘烨等[26]利用分子标记辅助选择抗稻瘟病基因，同时田间进行农艺性状的鉴定选择，获得了抗病、农艺性状优良的水稻恢复系。闫影等[27]以优质米品种‘南粳46’为母本、早熟香粳品种‘广陵香粳’为父本，通过杂交、回交并利用分子标记选择香味基因badh2-E7、软米基因Wx-mq，田间选择熟期，室内选择直链淀粉含量，培育成功了‘沪早香软1号’品种。本研究在秧苗阶段分子标记选择水稻抽穗期及香味基因，缩小了本田阶段育种材料群体，为田间准确地鉴定农艺性状提供了前提。分子标记与田间观察相结合培育的水稻‘黑大香1’具有香味、主茎叶片数13片、株型直立、大长粒、抗倒伏、适口性好及高产优质等特征。

Hd2(hd2)、Hd4(hd4)及Fgr(fgr)位点是决定黑龙江省水稻抽穗期及香味的主效基因，Hd2-Caps、Hd4-Caps及Fgr-SNP标记可以有效地鉴定选择Hd2(hd2)、Hd4(hd4)及Fgr(fgr)基因。田间目测观察水稻茎叶姿态、稻谷大小及形状、以及以手触摸茎秆基部判断耐压能力强弱等，选择株型、粒型、抗倒伏等农艺性状是可行及有效的。在水稻秧苗阶段，利用功能性分子标记选择目标基因及性状，缩小了本田阶段育种材料规模，保证了田间观察农艺性状的准确性。利用分子标记和田间农艺性状选择相结合的方法，培育出了‘黑大香1’水稻品系具有hd2hd2Hd4Hd4fgrfgr基因型及中熟、有香味、茎叶直立、抗倒伏、丰产、出米率高、大长粒、适口性好等特征，可以用于黑龙江省第1积温区下限良食味稻米生产。