结直肠癌患者血清组织蛋白酶B与IL-22、IL-17水平的相关分析*

兰巧芬,耿有全,张诗颜,陈 娟,陈喜霞,张惠冰

福建中医'药大学附属福鼎市医院检验科，福建福鼎 355200

结直肠癌(CRC)是常发生于结肠或直肠部位的恶性上皮性肿瘤。多年来该病的发病率和病死率一直居高不下，严重威胁着人类的健康和生命[1]。近十几年来，直肠癌的发病机制研究一直都是一个热门话题，也是一个世界难题。随着分子生物学和分子免疫学技术的发展和广泛应用，人们从基因水平、转录水平、蛋白水平及它们之间的信号通路方面和T淋巴细胞等方面对CRC进行了大量研究。既往研究发现组织蛋白酶与肿瘤的发生、发展密切相关，其中组织蛋白酶B(CB)在肿瘤转移中扮演重要角色。免疫方面，免疫细胞一直以来也是CRC发病机制研究的主要对象，但主要集中在T淋巴细胞，如Th17和Th22细胞。CB能够促进细胞因子[白细胞介素(IL)-23、IL-1β及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]的产生，而这些细胞因子正是Th17及Th22细胞分化所需物质[2-3]。

因此本研究拟探讨不同时期的CRC患者中CB水平与IL-17、IL-22水平的关系，进一步了解在CRC患者外周血中CB能否作为癌细胞转移的早期诊断的一个指标，这将有助于深入明确CRC新的发病机制，并为新的干预治疗策略提供线索。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年6月至2019年1月在福鼎市医院外科行CRC切除及肿瘤科明确诊断为CRC的患者82例作为CRC组。所有患者术前未进行放化疗，无感染性疾病，近期无服用免疫抑制剂病史，术后病理证实为结肠或直肠腺癌，原发灶不能切除者被排除。82例CRC患者中男45例，女37例；平均年龄(61±2)岁；按Dukes分期法分为A～B (Ⅰ～Ⅱ)期30例(低分化腺癌10例、高中分化腺癌20例)，C～D(Ⅲ～Ⅳ)期52例(低分化腺癌25例、高中分化腺癌27例)。选择30例健康志愿者为健康对照组，其中男15例，女15例；平均年龄(61±2)岁。本研究获得所有受试者本人同意及本院伦理委员会的批准。

1.2试剂及仪器 人CB ELISA试剂盒由上海复星生物工程公司提供，人IL-17和IL-22 ELISA试剂盒由武汉博士德生物工程公司提供；采用全自动酶标仪检测。

1.3方法 采集所有研究对象外周静脉血不少于4 mL，室温血液自然凝固10～20 min，3 500 r/min离心10 min左右。仔细收集上清液，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。应用双抗体夹心法(ELISA法)按试剂盒说明书分别测定标本中CB、IL-17和IL-22水平，采用全自动酶标仪测定，在450 nm处读取吸光度(A)值，测定值按标准曲线换算成CB、IL-17和IL-22水平。

2 结 果

2.1两组血清CB水平比较 CRC组患者血清CB水平明显高于健康对照组(P<0.05)。且随着病情发展，Ⅲ～Ⅳ期的CRC患者血清CB水平明显高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)，中高分化的CRC患者血清CB水平明显低于低分化的患者(P<0.05)，见图1。

注：*P<0.05;**P<0.01。

2.2两组研究对象血清IL-22、IL-17水平比较 CRC组患者血清IL-17、IL-22水平均明显高于健康对照组(P<0.05)，且随着病情发展，Ⅲ～Ⅳ期的CRC患者血清IL-17、IL-22水平明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)，中高分化的CRC患者血清IL-17、IL-22水平明显低于低分化的患者(P<0.05)，而中高分化的CRC患者血清IL-17、IL-22水平与健康对照组的差异无统计学意义(P>0.05)，Ⅰ～Ⅱ期CRC患者血清IL-22水平与健康对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、3。

注：*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

注：*P<0.05;**P<0.01。

2.3CRC患者血清中CB水平与IL-22及IL-17水平的相关性 CRC患者血清CB水平与血清IL-22水平呈正相关关系(r=0.835 1,P<0.001)；CRC患者血清CB水平与血清IL-17水平也是呈正相关关系(r=0.955 1,P<0.001)，见图4。

注：A表示CB水平与IL-17水平的相关性分析；B表示CB水平与IL-22水平的相关性分析。

3 讨 论

组织蛋白酶属于溶酶体半胱氨酸蛋白酶中的番木瓜蛋白酶超家族，有11种(B、C、F、H、L、K、O、S、V、W、X)，不同的组织蛋白酶在肿瘤的发展中起着不同的作用，比如在肿瘤中发挥增殖、血管再生、转移和浸润等作用[4]。近几年研究发现，CB在肿瘤时期表达明显增高,在肿瘤转移过程中起着重要作用，它能够降解基底膜、细胞外基质和结缔组织，促进肿瘤的侵袭和转移[4]。本研究显示CRC患者血清中的CB水平是高于健康者的，且随着肿瘤发展，Ⅲ～Ⅳ期CRC患者血清CB水平高于Ⅰ～Ⅱ期患者，随着肿瘤的分化程度增高而逐渐减低，与文献[5-6]报道的癌胚抗原(CEA)、糖类抗原199(CA199)水平与疾病发展和分化程度呈负相关相似，可更进一步有效反映CRC患者肿瘤细胞分化程度，对病情评估、对症治疗具有重要指导意义。

CRC发生、发展的最主要致病因素是肠内慢性炎症[7]，其中炎症细胞(CD4+T淋巴细胞等)及炎症因子是这一过程的重要参与者。越来越多的证据也说明了CD4+T淋巴细胞各亚群之间的平衡和它们的细胞因子网络是影响CRC发生、发展的关键因素[8-9]，其中IL-17和IL-22与CRC的发生、发展密切相关[10]。IL-17 是近年来新发现的促炎症细胞因子。研究表明，在胃癌、非小细胞肺癌、肝细胞肝癌及 CRC 等恶性肿瘤中，IL-17 均呈高表达[11]。 IL-22 是 Th22 细胞分泌的特征性细胞因子，其可能通过 STATA3 信号通路机制抑制结肠癌细胞凋亡，促进结肠癌生长和转移，IL-22 在溃疡性结肠炎和结肠癌中高表达与CRC的发生、发展密切相关[12]。在免疫方面，Th17细胞和Th22细胞都是由初始 CD4+T淋巴细胞经共刺激信号活化后，在不同因子的刺激下分别分化而来。Th17 是在 TGF-β、IL-1β、IL-23和 IL-6 的诱导下由初始 CD4+T淋巴细胞分化而来的，Th22是在TNF-α及IL-6的诱导下由初始 CD4+T淋巴细胞分化而来的。Th17和Th22都可分泌众多细胞因子，其中最具特征性的分别是IL-17和IL-22。近年研究发现CB可促进IL-1β、IL-23及TNF-α的产生[13]。SON等[14]提出，CB在Caspase-1成熟及促进炎症因子产生中扮演重要角色。那么，在CRC患者中，血清IL-17及IL-22高水平表达，且随着肿瘤发展，在Ⅲ～Ⅳ期的水平高于Ⅰ～Ⅱ期，随着肿瘤的分化程度增高而逐渐减低，CB水平与IL-22、IL-17水平呈正相关，因此本试验可初步探讨CB可能通过促进分泌细胞因子而诱导Th17及Th22细胞分化，促进CRC进展，具体的机制可通过体外实验及其他角度进一步探讨。

综上所述，CRC患者血清CB、IL-17、IL-22水平随疾病进展均明显升高，随肿瘤分化程度增高而减低，且CB水平与IL-17、IL-22水平呈显著正相关，这将为CRC转移的早期诊断及防治提供新的线索。