量子点作为荧光标记物在临床检测方面的应用研究进展

夏成静 综述，周小合 审校

中国科学院大学深圳医院(光明)，广东深圳 518106

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量子点作为一种极具应用前景的信号标记,与传统有机荧光染料相比,具有宽而有效的激发谱,窄而对称的发射谱,高的荧光量子效率,优异的光化学稳定性,方便、灵活的表面可修饰性,且不同尺寸量子点可以被同一波长的光激发，发射不同波长的荧光等独特的光学特性[1-2]，在生物分析中的应用日益广泛，尤其有望在多重检测方面发挥重要的作用。

1995 年ALIVISATOS和NIE两个小组几乎同时在《Science》上分别发表了量子点应用于不同生物体系实现量子点荧光标记的开创性工作,此后,关于量子点在生物领域应用研究工作的报道越来越多。

1 量子点荧光标记的基本原理

量子点即半导体纳米粒子或纳米晶,是指半径小于或接近于激子玻尔半径的半导体纳米晶粒。它们多由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素组成,性质稳定,直径在1～100 nm,这一微小的粒径导致了电子及空穴被量子限域,从而使分离的能级结构取代原来连续的能带,因此具备了一些类似大分子多环芳香烃的光学特性,即由高能量激发导致能级跃迁而产生荧光，而量子点同时具有传统荧光染料没有的多种物理和光学特性，在荧光标记领域正发挥着卓越的优势。

2 量子点在核酸检测方面的应用

以偶联上量子点的核酸作为探针，可以与目标物的核酸相杂交，通过检测量子点的荧光量来对目标物进行定量，灵敏度较普通荧光显色检测法更高，显示出卓越的标记特性。 杨向荣[3]利用Cd S/ZnS量子点标记能与肺癌肿瘤标志物miR-21互补的核酸结合，再利用磁珠核酸探针与miR-21配对，然后利用磁分离手段将磁珠从检测体系中分离，部分量子点探针因未捕获到miR-21而遗留在上清液中，通过检测上清溶前后的量子点荧光信号的强弱，实现对肺癌标志物miR-21的定性和定量检测，检测下限可达1 fmol/L，线性范围涵盖1 fmol/L～10 pmol/L，且具有较高的检测特异性。 GLIDDON等[4]利用荧光偏振技术通过QD525和 QD655同时检测结核杆菌GBP6 和TMCC1基因，实现了基于量子点光学特性的多重检测。LEE等[5]报道了基于535、575、620这3种激发荧光谱的量子点标记核苷酸检测尿中3种前列腺癌融合基因，获得了很好的线性范围和1 fmol/L的检测限，整个检测60 min内完成，证明了量子点用于核酸多重检测的优良特性。

3 量子点在蛋白检测方面的应用

量子点与核酸结合成为了基因研究的新宠，并且获得了非常满意的效果，但都需要首先对标本进行PCR扩增，才能达到检测效果。与传统荧光标记物相比，如果利用量子点灵敏度更高的特性，标记抗体蛋白，就可以不需要扩增步骤，在病程早期更快速地获得检测结果。吴思敏[6]制备了高荧光性的量子点肺癌肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)的高灵敏检测探针，检测探针和磁珠结合的捕获探针与CEA发生免疫反应形成三明治结构，利用磁力分离器对免疫复合物进行富集后，通过检测富集在磁珠表面的量子点荧光信号，实现对CEA定量检测的目的，该方法的检测灵敏度为38 pg/mL,较传统酶联免疫方法提高了约40倍，同时为实现对多种肿瘤标志物的同步检测，作者在建立高灵敏度单指标检测方法的基础上，实现了对肺癌肿瘤标志物CEA、细胞角蛋白19片段(CYPFA21-1)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)的同步检测，筛选出3种不同发射波长的量子点，即QD525、QD585、QD625，分别对NSE、CEA和CYPFA21-1单克隆抗体进行标记，待免疫反应完成后，通过荧光成像分析方法对富集在磁珠表面的量子点荧光信号的种类和强度进行直接读取，实现对多靶标抗原的定性与定量检测，该方法不仅灵敏度和检测范围满足临床需求，而且能够有效地节省时间、样品量和成本。MONTORO BUSTOS等[7]在质谱法中用量子点作为标记物标记Ab2抗体,不仅避免了量子点与不同的靶抗体进行复杂的交联，而且可以利用量子点的元素特性在质谱仪中进行多重检测和质量控制，灵敏度也远远高于ELISA等光谱测定方法，转铁蛋白的检测限可以达到0.23 fmol/L。

4 量子点与流式平台结合的应用

量子点以优于传统荧光标记物的特性用于核酸和蛋白质的多重及高灵敏检测已获得业界的肯定，但检测平台的不足限制了它在多重性检测方面的优势。胡晓璐等[8-11]采用量子点流式微球技术，在流式细胞仪上根据散射光检测携带特异性抗体的微球以确定检测物质，以量子点荧光强度确定检测物质的量，分别检测了曲霉菌半乳甘露聚糖、胰岛素抗体、降钙素原和胃癌相关抗原 MG7，并对精密度、线性范围、灵敏度进行评价，都优于传统的检测方法，并展望了利用不同大小免疫微球和不同粒径量子点结合用于多重检测的可能性。 CABRAL FILHO等[12]在流式细胞仪上用530 nm和580 nm的量子点标记血型抗体检测红细胞上的多种血型抗原，不论是灵敏度还是特异度都获得了满意的效果。BRAZHNIK等[13]建立了利用发射不同荧光谱的量子点微球标记不同的抗体，在流式细胞仪上多重检测前列腺癌特异抗原，与ELISA相比,无论是速度、成本，还是检测限都有巨大的优势。BILAN等[14]用3种不同尺寸由量子点组装成的微球分别标记3种肺癌特异性抗原，在流式细胞仪上对肺泡灌洗液进行检测，与传统的Luminex xMAP系统比较获得很好的相关性。

由于量子点的优异光学特性，越来越多的学者利用量子点带来的高灵敏度，结合流式检测平台用于许多丰度较低的物质检测。 LIN等[15]将CuInS2/ZnS 量子点与Fe3O4复合成多聚微球，微球与抗FcεRIa单克隆抗体偶联后在流式细胞仪上检测血清中的FcεRIa，发现SLE患者与健康人有明显差异，检测限可达到0.29 ng/mL。SHANDILYA等[16]用量子点偶联的蛋白探针微球在流式细胞仪上检测与AGO2蛋白结合的胞外miRNAs，也获得了很好的灵敏度和特异度。同时，蔡冰洁等[17]建立了一种量子点的流式微球技术，用于高通量的DNA检测，将能与靶DNA一端杂交的探针DNA(P1)标记在微球表面，与DNA配对杂交后，加入能与靶DNA另一端杂交的量子点标记的探针DNA(P2)，组装成一种流式微球-探针P1、靶DNA、量子点-探针P2的夹心复合结构，通过测定杂交前后平均荧光强度的变化检测DNA的浓度，该新型检测方法可以区分出完全互补、单碱基错配及完全非互补的DNA。

5 量子点多重检测的展望

量子点代替传统荧光物质与流式微球技术结合既可以发挥量子点灵敏度高和荧光稳定性强的特点[18]，也可由它宽而有效的激发谱、窄而对称的发射谱、荧光发射谱随粒径大小可调、且可以做到互不干扰的特性使它与不同大小微球进行组合在流式平台上进行检测，可以满足临床多重检测的需要。目前不同颜色的量子点也可以渗入到微球内部或组装成微球成为编码微球，根据量子点的荧光颜色和强度用于多种物质的同时检测[19-20]，但量子点的泄漏和工艺仍然是国内阻碍量子点编码微球在多重检测方面的重要因素,但随着传统荧光染料在Luminex及流式平台上多重检测的限制，比如荧光谱的重叠补偿和荧光激发器需要量的增加，使具有多重编码优势的量子点微球逐渐替代传统荧光染料成为现实[21-22]。

量子点作为一种极具应用前景的信号标记,虽然现在临床只用于一些炎症指标等的单重免疫检测，在多重检测和流式方面的应用还只是停留在实验室研究阶段，它的最佳荧光发射需要紫外光的激发阻碍了其与其他检测平台的结合和限制了它的应用。但随着流式细胞仪激发光选择性的增加(最先进的流式细胞仪已可提供405 nm的激发波长)，以及为了适应量子点的多重检测，新的检测仪器可能被开发出来，可以为量子点的激发提供紫外附近的光源，如果和流式微球技术相结合使得量子点成为临床最受欢迎的多重荧光标记物成为可能，使其成为多重、高通量、高灵敏的标记物逐渐成为现实。