辛伐他汀减轻放射性肺损伤的初步研究

王金凤，王春丽，郭海亮，黄 莉，王祥财，叶建明

（赣南医学院第一附属医院肿瘤科，江西 赣州 341000）

恶性肿瘤是全世界最严重的疾病之一，严重威胁人类的生命健康，而胸部肿瘤在恶性肿瘤中占很大比例，如肺癌、乳腺癌、食管癌、纵隔恶性肿瘤。放射治疗是胸部恶性肿瘤的主要治疗方法之一，但在放疗过程中，正常肺组织不可避免地受到射线照射，导致急、慢性放射性肺损伤，放射性肺损伤主要包括早期的放射性肺炎和晚期的放射性肺纤维化，严重影响患者的治疗疗效。目前，寻找疗效可靠、不良反应小的放射防护剂仍是今后放射治疗研究的热点和难点。近年研究发现，辛伐他汀除了降脂作用外［1］，还具有抗氧化、抗炎、减轻放射性皮炎及肠炎、减少唾液腺等作用［2-4］。本研究通过建立小鼠放射性肺损伤模型，观察辛伐他汀对放射性肺损伤的防治作用，并初步探讨其可能的作用机制，为临床应用辛伐他汀防治放射性肺损伤提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂及主要仪器辛伐他汀（Simvas⁃tatin）购自美国sigma 公司（纯度≥98%）。转化生长因子βl（TGF-β1）ELISA 试剂盒，肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA、羟脯氨酸（Hyp）测试盒（海门碧云天生物技术研究所），超氧化物歧化酶（SOD）、微量丙二醛（MDA）、HE 染液及Masson 染液试剂盒（南京建成生物工程研究所）。倒置显微镜（日本Olymbus公司，CKX41-C31BF），紫外分光光度计（南京五义科技有限公司，OD-1000+），酶标仪（美国Bio Rad 公司，680），生物组织切片机（武汉俊杰电子有限公司，JJQ-P2016A），放射治疗机器（美国瓦里安公司）。实验动物，雌性，12 周龄，4～6 只1 笼，饲料、饮水不限，在无特定病原体（Specific pathogen free，SPF）级条件下饲养。

1.2 分组及动物模型健康雌性C57BL/6 小鼠80只，体重为13～16 g，由南通大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（苏）2008-0010。小鼠按随机数字表法分为空白组（不照射，予生理盐水0.3 mL/只）、单药组（不照射，予辛伐他丁原液）、单放组（胸部照射）、联合组（胸部照射+予辛伐他丁原液），每组20只。单放组和联合组需行放射性肺损伤造模，将小鼠麻醉后仰卧固定在鼠板上，充分暴露其胸部，其余部位加以挡铅，采用6Mv X射线照射全肺，源皮距100 cm，吸收剂量率2.6 Gy·min-1，总剂量为15 Gy。照射后4 h，单药组和联合组小鼠每天辛伐他汀10 mg·kg-1灌胃，单放组和空白组每天饲以0.9%氯化钠溶液，连续灌胃30 d。

1.3 实验标本收集及处理连续灌胃30 d 后，分别于照射后8 周、16 周、24 周3 个时间点，每组随机取5 只小鼠活体取材。腹腔注射3.6%水合氯醛麻醉各组小鼠，将小鼠麻醉后，心腔取血，静置于4 ℃冰箱1 h 后，4 ℃离心15 min，取上清液，－80 ℃保存。取血后，立即打开胸腔取肺组织，用4%多聚甲醛溶液固定，－80 ℃冻存备用，右肺用于检测MDA含量、SOD 活力及Hyp 含量，左肺固定于10%缓冲性甲醛液中，用常规法石蜡包埋，切片备用，经HE染色和Masson染色后进行光镜观察病理改变。

1.4 病理学观察将冻存备用的左肺组织用常规法石蜡包埋，切片，HE 染色及Masson 染色，在光学显微镜下观察肺组织病理组织形态学观察。

1.5 检测指标采用ELIAS 法检测血清中TNF-α、TGF-β1及Hyp 的含量；采用紫外分光光度计进行MDA含量、SOD活力测定。

1.6 统计学处理使用SPSS 13.0 统计软件包进行数据分析。采用one-way 方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠一般情况空白组和单药组在试验期间，精神、进食、体重等都表现正常。单放组小鼠照射后出现精神萎靡、进食量减少、活动迟缓、体重减轻；2 周后照射野内皮毛脱落、变白，部分小鼠出现呼吸频率加快，至24 周照射野皮毛基本全部脱落。联合组小鼠第3 d 后出现精神欠佳，3 周后精神逐渐改善，进食量、活动、体重变化均较单放组好，照射野内仅少量皮毛脱落、变白。

2.2 病理组织学观察HE 染色空白组和单药组小鼠肺组织结构清晰，肺泡、肺泡壁及支气管结构正常，肺间质无增厚及炎性细胞浸润。单放组在照射后8 周可见明显肺间质充血、水肿及炎性细胞浸润；第16周时炎症轻度减轻，可见肺泡壁增厚，肺泡腔轻至中度变小；第24 周时肺组织结构紊乱，肺泡间隔明显增厚、进行性纤维化，肺泡腔明显萎陷变小。联合组在照射后8周可见轻到中度急性炎症改变；第16周可见炎症明显减轻，无明显肺泡壁增厚，肺泡腔轻度变小；第24 周时炎症明显减轻，肺间质增厚，肺组织结构轻微破坏（图1）。Masson 染色空白组和单药组未见明显肺纤维化，单放组小鼠肺组织第8 周即有少许放射性肺纤维化；第16 周放射性肺纤维化形成增多；第24周时显著增多。联合组在照射后各时间点与单放组比较肺纤维化程度均降低（图2）。

图1 各组小鼠肺组织病理变化（HE染色，×100）

图2 各组小鼠肺组织病理变化（Masson染色，×100）

2.3 小鼠肺组织羟自由基含量血清Hyp 含量可反映在自由基攻击下引起受照射组织炎症的严重程度。各时间点（8周、16周、24周）联合组小鼠血清Hyp 含量低于单放组，但仍较空白组和单药组有所升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；空白组和单药组小鼠血清Hyp 含量差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

2.4 小 鼠 血 清 中TNF-α、TGF-β1 的 表达 水 平放射线照射后，可引起体内TNF-α、TGF-β1等炎性因子表达水平的升高。实验结果显示，照射后TNF-α和TGF-β 各时相均升高，联合组TNF-α 和TGF-β1略高于空白组和单药组，均比单放组降低，差异有统计学意义（P＜0.05），空白组和单药组相比差异则无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表1 照射后各时间点小鼠肺Hyp含量/μg·g−1

2.5 小鼠肺组织MDA 含量变化联合组小鼠肺组织MDA 含量，各时间点均略高于空白组和单药组，但与单放组相比降低，差异有统计学意义（P＜0.05），空白组和单药组的MDA 含量比较差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

2.6 小鼠肺组织SOD 活性变化联合组小鼠肺组织SOD 活性，各时间点均略低于空白组和单药组，但与单放组相比升高，差异有统计学意义（P＜0.05），空白组和单药组的SOD 活性比较差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

表2 照射后各时间点各组小鼠血清TGF−β1、TNF−α/ng·mL−1

表3 照射后各时间点各组小鼠肺组织SOD活性、MDA含量

3 讨 论

胸部肿瘤在放射治疗中最常见的并发症是放射性肺损伤，其包括放射性肺炎和放射性肺纤维化。随照射时间延长放射性肺损伤逐渐加重，肺泡的病理变化为肺充血、水肿、肺间质增厚及肺泡腔萎陷变小，后期出现肺泡间隔进行性纤维化的特征性损伤。本实验研究表明，通过HE 染色和Masson染色证实放射性肺损伤的病理改变是一个动态发展过程，联合组与单放组比较放射性肺炎炎症反应及肺纤维化程度均明显降低，表明辛伐他汀可缓解小鼠放射性肺损伤。

放射性肺炎多发生在放疗治疗后6 周左右，其机制是射线直接作用于正常肺组织，产生大量的活性氧自由基，然后直接作用于DNA，引起DNA 断裂和脂质过氧化，从而启动诱导细胞凋亡和炎症反应等一系列基因活化的级联效应，最终导致组织细胞损伤［5］。MDA 是脂质过氧化的最终产物之一［6］，因此该实验选择测定照射后肺组织MDA含量，其可以间接反映肺组织细胞脂质过氧化损伤的严重程度。联合组小鼠在各时间点MDA含量与单放组相比，均显著降低，说明辛伐他汀能够减轻放射肺损伤引起的脂质过氧化。

KARBOWNIK 等［7］报道，射线照射后细胞的抗氧化酶活力降低，而抗氧化剂通过提高抗氧化酶活力可减轻细胞的放射损伤。SOD 能清除超氧阴离子自由基，从而保护细胞免受放射损伤，其对机体的氧化与抗氧化水平起着极其重要的调节作用。另外，SOD 活性的高低能够反映组织细胞清除超氧阴离子的能力。本研究结果显示，单放组MDA含量各时间点均显著低于联合组，说明射线照射可致小鼠肺组织的SOD 活性降低，而辛伐他汀可缓解这一效应，从而发挥抗氧化损伤的防御反应，达到防治放射性肺损伤的作用。

目前研究表明，可能致放射性肺纤维化的细胞因子很多［8］，其中以肿瘤坏死因子（TNF-α）和转化生长因子β1（TGF-β1）较为重要［9］。TNF-α 通过改变血管内皮细胞通透性，加强血管渗出，刺激中性粒细胞等炎性反应细胞的趋化反应，诱导前列腺素合成，最终加重炎性反应［10］。TGF-β1可促进成纤维细胞分裂增殖及其成熟分化，促进胶原蛋白、黏蛋白等细胞外基质成分的基因转录及蛋白合成［11］，而羟脯氨酸是胶原蛋白中的一种特有成分，能间接反映肺内胶原纤维代谢状况［12］。与众多相关研究结果一致［13］，本实验结果显示，单放组TGF-β1和TNF-α水平明显高于联合组，而单放组肺内Hyp含量高、肺损伤程度重，表明辛伐他汀能够降低放射性肺损伤小鼠体内细胞因子TGF-β1和TNF-α 水平的表达，从而减轻放射性肺损伤

本实验通过建立C57/bl 小鼠放射性肺损伤模型，观察放疗后8 周、16 周、24 周辛伐他汀对放射性肺损伤的放射防护作用，结果表明辛伐他汀对小鼠肺组织的放射损伤具有放射防护作用，其可能机制是通过利用辛伐他汀的抗脂质过氧化及下调TGF-β1、TNF-α 等炎症因子的表达，从而达到预防肺组织免受放射损伤的目的。此外，本研究发现空白组和单药组组织损伤无差异，结果表明辛伐他汀对组织几乎无毒性。因此，辛伐他汀有望成为一种安全有效的预防和减轻放射性肺损伤的药物。