基于Nrf2通路探讨曲克芦丁对急性脑梗死大鼠神经功能的保护作用

辛 月，郭 伟

急性脑梗死(acute cerebral infarction, ACI)是目前临床上极为常见的脑血管疾病，具有较高的致残率和病死率，严重威胁着中老年人的健康[1]。随着人们生活模式和饮食结构的转变，ACI发病率逐年升高且呈年轻化趋势，目前其发病率已超过脑血管疾病的75%[2]。曲克芦丁是一种半合成的黄酮类化合物，对脑缺血损伤有显著的保护作用及抗炎、抗过敏作用，但临床上通常将曲克芦丁与依达拉奉等药物协同使用，因此曲克芦丁的具体机制尚不清楚[3-4]。氧化应激是脑缺血再灌注损伤的主要环节，核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor， Nrf2)途径是机体内最重要的抗氧化应激系统[5-6]。本研究通过“线栓法”制备ACI模型，基于Nrf2途径探讨曲克芦丁对ACI大鼠神经功能的保护作用，旨在为临床治疗ACI提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 曲克芦丁片(山西亚宝药业集团股份有限公司，国药准字： h14022940)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗大鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2、Nrf2、血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)、醌氧化还原酶1(quinoneoxidoreductase 1, NQO1)、GAPDH抗体均由Abcam公司提供。

1.2实验动物及分组 清洁级雄性8周龄SD大鼠30只，体重(160±20)g；购自华中科技大学动物实验中心，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2016-0009。30只大鼠随机分为假手术组、模型组和干预组，每组10只。均适应性饲养1周。

1.3造模及用药 模型组和干预组大鼠均参照文献[7]中的方法制备ACI动物模型，具体操作：大鼠进行乙醚吸入麻醉后采取仰位固定，在颈部中位处切口，暴露颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，用浸过肝素的拴线由颈内动脉插入至大脑前动脉，进行结扎操作，完成后逐层进行缝合；持续2 h后，小心拆开缝合处，缓慢拔出拴线，恢复该处的血流灌注，再次缝合。假手术组大鼠进行手术，但不结扎。ACI模型制备完成后，干预组立刻给予曲克芦丁片30 mg/kg灌胃，假手术组和模型组给予等量生理盐水灌胃，均连续用药10 d。

1.4神经功能评分 根据参考文献[8]中的方法，在末次给药后对3组大鼠进行神经功能评分：将大鼠放到地上，出现向缺血对侧转圈情况，计1分。捏住大鼠尾巴提起后，出现缺血对侧的肩内旋计3分，前肢肘屈曲计2分，腕屈曲计1分。对大鼠缺血对侧推动时阻力减小，按照减小程度计1～3分；将大鼠放在金属网上，根据缺血对侧肌张力的下降程度计1～3分。

1.5旷野实验 按照参考文献[9]中的方法：测试前给予大鼠抓取刺激，之后立刻让大鼠进入敞箱中进行活动性测试(保证测试周围环境安静)。每只大鼠测定1次，每次3 min，根据大鼠穿越底面块数为水平活动得分，以直立次数为垂直得分。每只大鼠测定后清洁敞箱，避免对下一个大鼠的实验结果造成影响。

1.6苏木精-伊红(HE)染色 3组大鼠进行麻醉后断头取脑，去除脑组织中的嗅球、小脑和低位脑干后，在4%多聚甲醛溶液中固定3 d，进行石蜡制片后行常规HE染色，利用倒置光学显微镜观察脑组织的神经元形态结构。

1.7脑组织中SOD、MDA、LDH、iNOS含量测定 3组大鼠进行麻醉后断头处理，剥取无海马组织的脑组织，研磨之后制成匀浆，经过15 min的低温离心后得到上清液，严格按照相关试剂盒步骤处理后，用紫外-可见分光光度计测量SOD的活性、MDA、LDH、iNOS的含量。

1.8Western blot检测脑组织中Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Bcl-2、Bax、Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平 3组大鼠进行麻醉后断头处理后，剥取脑组织50～100 μg，匀浆器中采用无菌剪刀剪碎，进行BCA蛋白定量、高温蛋白变性，电泳，等到溴酚蓝快到胶底部的时候停止，然后进行转膜、春红溶液染色，在室温条件下用5%脱脂奶粉进行2 h的封闭处理，对应一抗、GAPDH(1∶1000)4℃过夜；洗膜，二抗(1∶100)在37℃条件下恒温孵育1 h后电致化学发光(ECL)显色。由Quantity-one软件分析Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、Nrf2、HO-1、NQO1蛋白条带。

2 结果

2.1大鼠一般情况 假手术组大鼠饮食正常，活动规律。模型组大鼠活动少，部分大鼠出现躁动、喂养困难及体重增长缓慢的情况。干预组大鼠精神状态得到改善，饮食量也明显增加。实验过程中3组均未出现大鼠死亡情况。

2.2神经功能评分及旷野实验结果比较 模型组大鼠神经功能评分高于假手术组，旷野实验的水平得分和垂直得分均低于假手术组，差异均有统计学意义(P<0.01)。干预组大鼠神经功能评分低于模型组，旷野实验的水平得分和垂直得分均高于模型组，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 3组大鼠的神经功能评分及旷野实验结果比较分)

2.3大鼠脑组织病理改变 假手术组大鼠海马区神经元染色均匀，层次分明，结构完整排列致密规则。模型组大鼠海马区神经元细胞层次紊乱，染色不匀，排列疏松，伴随有细胞碎片及空泡改变。干预组大鼠海马区神经元细胞空泡样改变及神经元损伤性病理变化较模型组减轻。见图1。

图1 3组大鼠脑组织海马神经元病理变化情况(HE×400)模型组为ACI模型，干预组给予曲克芦丁片；ACI为急性脑梗死

2.4大鼠脑组织SOD、MDA、LDH、iNOS含量比较 模型组大鼠脑组织中MDA、LDH、iNOS含量高于假手术组，SOD含量低于假手术组，差异均有统计学意义(P<0.01)。干预组大鼠脑组织中MDA、LDH、iNOS含量低于模型组，SOD含量高于模型组，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 3组大鼠脑组织SOD、MDA、LDH、iNOS含量比较

2.5大鼠脑组织Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达量比较 模型组大鼠脑组织中Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Bax蛋白表达量高于假手术组，Bcl-2蛋白表达量低于假手术组，差异均有统计学意义(P<0.01)。干预组大鼠脑组织中Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Bax蛋白表达量低于模型组，Bcl-2蛋白表达量高于模型组，差异均有统计学意义(P<0.01)。见图2、表3。

表3 3组大鼠脑组织中Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达量比较

图2 3组大鼠脑组织中Cleaved-Caspase-3、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达情况模型组为ACI模型，干预组给予曲克芦丁片；ACI为急性脑梗死

2.6脑组织Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达量比较 模型组大鼠脑组织中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达量低于假手术组，差异有统计学意义(P<0.01)。干预组大鼠脑组织中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达量高于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图3、表4。

表4 3组大鼠脑组织中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达量比较

3 讨论

ACI发生后会增加脑组织血管通透性，使得血管内的氧自由基、钙离子及兴奋性氨基酸水平升高；同时脑细胞代谢障碍又会导致炎性细胞因子合成，破坏血管壁加重脑组织缺血症状[10]。目前ACI治疗的核心在于恢复缺血区域血流灌注，缓解缺血症状；但脑缺血后再灌注损伤是治疗后常见的并发症，会引起更为强烈的氧化应激以及炎症反应[11]。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组神经功能评分明显升高，旷野实验水平得分及垂直得分明显降低，并且脑组织HE染色也显示神经元结构损伤严重；干预组神经功能评分显著降低，旷野实验水平得分及垂直得分明显升高，并且脑组织神经元结构损伤也得到了明显的修复。表明曲克芦丁具有保护神经功能的作用。曾静等[12]研究发现，曲克芦丁具有保护神经血管单元结构的作用，可能是通过抑制iNOS和基质金属蛋白酶-9的表达，减少3-硝基酪氨酸的产生来实现。但缺血性损伤以及缺血再灌注损伤都会引起机体的氧化应激反应；而Nrf2途径作为机体抵抗内外界氧化及刺激的防御性信号转导通路，其内源性抗氧化应答机制在氧化应激过程中发挥着重要的作用[13]。因此本研究基于Nrf2通路来探究曲克芦丁对ACI大鼠神经功能的保护作用。

脑缺血及再灌注损伤会导致体内产生大量活性氧(ROS)，SOD、过氧化氢酶等抗氧化酶中和ROS的速度及活性受限，引起ROS失衡；没还原掉的ROS会对细胞膜造成严重的氧化破坏，MDA就是该过程的终产物之一[14]。LDH对于脑组织损伤最为敏感，因此其水平升高常用于反映脑组织损伤程度[15]。同时iNOS也会被这些刺激激活，持续产生大量的一氧化氮，造成毒害作用[16]。Nrf2是一种重要的抗过氧化反应的蛋白，当机体产生氧化应激反应时，Nrf2能够迅速地磷酸化激活并转移至细胞核中，通过作用下游ARE蛋白，从而促进HO-1、SOD1、NQO1等抗氧化蛋白表达，对细胞和器官起到保护作用[17]。本研究结果显示，模型组脑组织中MDA、LDH、iNOS含量显著升高，而SOD含量及Nrf2、HO-1、NQO1表达水平显著降低。干预组MDA、LDH、iNOS含量降低，而SOD含量、Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达明显升高。表明曲克芦丁能够诱导Nrf2通路激活，诱导下游抗氧化蛋白合成，增强ROS的还原能力，缓解脑组织中过量ROS引起的氧化应激损伤。

神经元细胞的凋亡是神经损伤最直接的影响因素，本研究通过对脑组织中凋亡途径相关蛋白的表达水平分析发现，曲克芦丁能够明显抑制“死亡执行蛋白酶”Caspase-3的表达[18]，同时还能够抑制Bax/Bcl-2比值。Bax/Bcl-2是调控细胞凋亡过程且功能相互对立的基因，也是调控线粒体凋亡途径的关键蛋白[19]，说明曲克芦丁可能激活Nrf2信号通路，促进体内SOD、HO-1、NQO1等抗氧化酶的合成分泌，增强ROS的还原能力，减轻ROS对线粒体膜氧化损伤，并减少一氧化氮对细胞的毒性作用，抑制神经元细胞凋亡从而发挥神经保护功能。

综上所述，曲克芦丁可能通过促进Nrf2/HO-1/NQO1通路缓解大鼠ACI后的氧化损伤，抑制神经元细胞凋亡，保护神经功能。本研究初步揭示了曲克芦丁作用于ACI氧化应激的可能调控机制，但ACI引起的脑损伤因素较多，曲克芦丁还可能在其他途径发挥保护神经功能的作用，有待进一步研究。