基于类风湿关节炎的基因表达芯片的差异分析

陈 璞

（东莞市第八人民医院，广东 东莞523000）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种与遗传、环境等因素密切相关的慢性全身性炎症性疾病，全球发病率为0.5%～1.0%［1］，主要发病人群为中老年人，且女性发病率高于男性［2］。现代基因测序技术可以同时检测几万个基因的表达值，可用于研究RA的发病机制，对RA滑膜组织采用新的测序技术来进行表达谱分析。YOSHIDA等［3］发现与骨关节炎患者相比，RA患者滑膜中与炎症相关的STAT1、IRF1、CXCL9、CXCL10和CCL5基因表达量明显升高。YAMAGUCHI等［4］发现RA女性患病率高于男性，提示女性性激素可能参与该病的发病机制。DEL等［5］研究表明低氧诱导了健康滑膜成纤维细胞（HSF）和RA滑膜成纤维细胞（RASF）基因表达的显著变化，并证实了RASF和HSF之间的差异。目前，虽然有大量研究工作正在探索RA的发生机制［6-9］，但是其发病原因及机制尚不明确。RA发病机制的研究对RA的早期诊断及有效治疗具有重要意义。

本研究的RA相关数据来自美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）数据库共享的基因表达谱数据。本文利用R语言limma包对GSE55235［10］表达谱数据进行预处理、差异表达分析等，得到与RA相关的差异表达基因，然后对表达差异的基因做基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，最后通过STRING数据（http：//www.string-db.org/）构建蛋白质相互作用的网络图，筛选网络拓扑结构中与RA发生发展过程有关的关键基因，发现基因节点的接近度越大，表明越重要。本研究的主要目的是筛选与RA发病机制相关的重要基因，并探索RA的潜在分子发病机理。

1 材料与方法

1.1 基因表达数据库芯片数据的获取 基因表达数据库（gene expression omnibus，GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）是NCBI网站到目前为止最全面的公开基因测序数据集［11］。从NCBI下 载 基 于Affymetrix human genome U133A芯片的基因表达谱芯片数据GSE55235，平台为Affymetrix GPL96，其中包含来自正常膝关节的10个正常滑膜组织样本以及10个类风湿关节炎关节滑膜组织样本。

1.2 差异表达基因的筛选RA表达芯片数据利用R语言的affy包［12］进行预处理和limma包［13］进行差异表达分析，筛选出表达差异基因。其中筛选条件为P＜0.01且logFC＞1，对得到的差异基因进行火山图显示和热图的分类效果图分析。

1.3 差异基因的GO和KEGG富集分析 为了解差异基因的生物学功能，采用R语言的cluster Profiler包［14］对与RA相关的差异基因进行了GO和KEGG生物功能富集分析。其中GO富集分析分别从生物进程（biological processes，BP）、细胞组成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）等三方面进行。KEGG富集分析针对差异基因富集的通路，通过超几何检验计算差异基因与通路的显著性P值，根据通路中的基因数据＞10且P＜0.01条件得到与RA发生与发展密切相关的信号通路。

1.4 PPI网 络 构 建STRING数 据（http：//www.string-db.org/）是蛋白质之间的相互作用网络的数据库［15］。其中包含蛋白质之间的直接相互作用和间接相互作用。本研究通过R语言STRINGdb包［16］构建类风湿关节炎差异基因的蛋白质交互（protein-protein interaction，PPI）网络。

2 结果

2.1 差异基因分析 通过affy开始进行原始芯片归一化处理，然后通过R语言limma包的差异分析，最终得到876个差异表达基因，其中上调基因536个，下调基因340个。差异表达基因结果见火山图（图1），方形代表上调基因；圆形代表下调基因；三角形代表无差异基因。利用R语言中的pheatmap包绘制基因热图，通过差异基因对正常样本与异常样本进行分类，分类效果明显，见图2。

图1 RA差异表达基因的火山图

图2 RA差异基因的热图分析

2.2 差异基因GO富集分析结果GO富集分析结果在生物进程（BP）中，差异基因主要富集在白细胞迁移（Leukocyte migrate）、白细胞间的粘连（Leukocyte cell-cell adhesion）、抗原受体介导的信号通路（Antigen receptor-mediated signaling pathway）、细胞活化的正调节（regulation of lymphocyte activation）及T细胞激活（T cell activation）中。在细胞组成（CC）中，主要富集在质膜的外侧（External side of plasma membrane）、三级颗粒（Tertiary granule）、膜区（Membrane region）、膜筏（Membrane raft）、膜微区（Membrane microdomain）中。在分子功能（MF）中，主要富集在糖胺聚糖结合（Glycosaminoglycan binding）、MHC蛋白复合物结合（MHC protein complex binding）、细胞因子受体活性（Cytokine receptor activity）、细胞因子结合（Cytokine binding）、硫化合物结合（Heparin binding）中，见表1。

表1 显著的GO和KEGG通路分析的结果

2.3 差异基因KEGG富集分析结果 为了得到与类风湿关节炎相关通路，通过cluster Profiler包对类风湿关节炎相关的差异表达基因进行了KEGG通路富集分析，发现差异基因主要集中在Osteoclast differentiation、Leishmaniasis、B cell receptor signaling pathway、Primary immunodeficiency、Hematopoietic cell lineage、Rheumatoid arthritis、Th17 cell differentiation、Epstein-Barr virus infection、T cell receptor signaling pathway等通路中。结果见表1。

2.4 差异基因的PPI网络分析结果 笔者使用R语言STRINGdb包处理构建了包含706点、1 245个边的PPI网络，见图3。在PPI网络中进行网络拓扑学分析，通过每个节点的接近度值的大小来表示该基因在网络中的重要性大小，接近度值位列前10名的基 因 分 别 为EGFR、CD8A、CCR7、RAC2、EGR1、PPARG、CDKN1A、CD4、ZAP70和JUN，预示着这些基因可能与RA的发病机制有关，见表2。

图3 RA差异表达基因PPI网络图

3 讨 论

类风湿关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，其特征是滑膜增生、浸润和软骨降解。本文通过对RA患者样本与正常样本进行基因表达谱的对比分析，筛选了876个差异表达的基因转录本，参与了类风湿关节炎趋化因子信号通路、T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路、Th17细胞分化和病毒性心肌病等信号通路，涉及了白细胞迁移、免疫反应激活细胞表面受体信号通路、细胞活化的正调节、T细胞激活等生物学过程。笔者进一步通过PPI网络分析得到关键基因，包括EGFR、CD8A、CCR7、RAC2、EGR1、PPARG、CDKN1A、CD4、ZAP70和JUN。

表2 PPI网络中前10名差异基因的接近度情况

EGFR（epidermal growth factor receptor）是上皮生长因子（EGF）细胞增殖和信号传导的受体。HUANG等［17］研 究 表 明RA与EGFR基 因 中 的rs17337023 SNP有关，并且血清EGFR蛋白水平升高。这些发现表明EGFR作为RA的治疗靶点值得进一步研究。研究发现16个基因的签名可以有效区分RA与骨性关节性（OA），其中包括CD8A基因，提出以CD8A为特征的分类方法可以改善RA患者的诊断和治疗［18］。另有研究表明CCL21/CCR7信号转导在RA发病机理具有不同阶段的功能意义，CCR7是RAM1滑液（SF）巨噬细胞的标志，它在RA单核细胞和体外分化的巨噬细胞中的表达与疾病活动评分（DAS28）密切相关［19］。趋化因子受体CCR7及其配体CCL19和CCL21指导树突状细胞和T细胞在淋巴器官中的归巢和定位，从而有助于适应性免疫和免疫耐受的多个方面。文献［20］调查了CCR7在胶原诱导的关节炎（CIA）发病机理中的作用。通过使用新型抗人CCR7抗体和人源化CCR7小鼠，评估了CCR7作为类风湿关节炎（RA）自身免疫模型的靶标。DEY等［21］发现RA滑膜和巨噬细胞中iNOS相互作用蛋白ras相关的C3肉毒杆菌毒素底物2（RAC2）的一致上调。重要的是，他们已经构建了一个模型来解释IFN和IL-10途径对Rac2-iNOS相互作用的影响，该相互作用导致NO的过量产生，从而引起RA滑膜的慢性炎症。因此，STAT1和RAC2在NO调节中的相互作用可能对RA的治疗靶标的确定有影响。差异甲基化基因（DMG）可能参与神经营养因子信号传导途径、癌症途径、ECM-受体相互作用和RA中的粘着通路。此外，CTCF、c-MYC、YY1和EGR1可通过调节差异甲基化基因（DMG）在RA中发挥重要作用［22］。JALIL等［23］研究表明，PPARG基因的编码变体Pro12Ala（rs1801282）与巴基斯坦人的类风湿关节炎发病有关。还有些研究结果表明，miR-146a抑制可以增强CDKN1A的过度表达，抑制HFLS-RA的侵袭增殖［24］。针 对EGFR、CD8A、CCR7、RAC2、EGR1、PPARG、CDKN1A、CD4、ZAP70和JUN基因的检测与靶向治疗将有助于RA的早期诊断与治疗。

综上所述，本研究通过生物信息分析方法筛选出RA的表达差异基因，进行富集分析及PPI网络分析，得出与RA发生发展相关的关键基因，有助于类风湿关节炎的早期诊断和治疗，为寻找与RA发生发展及治疗相关靶点的研究提供有价值的依据。