豫南稻区特种稻主要农艺性状及矿质元素含量分析

雷振山，武浩，卫云飞，周强，刘娟，刘秋员，季新，王付娟

(信阳农林学院，河南 信阳 464000)

水稻(OryzasativaL.)是中国重要的粮食作物，中国有60%以上人口以稻米为主食。自2011年以来，中国水稻年产量已连续9 a保持在2亿t以上，对保障中国粮食安全具有重要战略意义。近年来，随着中国经济的快速发展，人民生活水平的不断提高，水稻供需结构发生显著变化，消费市场对稻米品质和功能营养的要求越来越高。人们对外观好、食味佳的优质稻米需求不断增加，对高钙米、富铁米、富锌米和低蛋白米等功能性稻米消费日益扩大[1]。因此，选育、研究和开发优质营养的功能性稻米符合中国水稻产业发展和市场需求。

特种稻作为一类具有特定遗传性状和特殊功效的水稻受到人们关注，其主要包括有色稻、香稻和专用稻[2]。有色稻因其果皮和种皮内积累有花色素苷或原花色素而分别呈现不同程度的紫黑色或红褐色，内含的天然色素具有明显的抗氧化作用，富含的铁、锌等微量元素使有色稻米具有独特的营养保健功能[3]。香稻是一类具有浓郁芳香气味的稻米，2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroli,2-AP)是引发稻米香味的主要物质[4]。水稻第8染色体上的甜菜碱醛脱氢酶2基因(Badh2)被认为是控制稻米香味的主要基因，BADH2蛋白功能丧失使香味物质2-AP积累，稻米具有香味[5]。专用稻则是具有专门用途的一类水稻，如酿酒所用的糯稻等。豫南稻区地处亚热带向暖温带过渡区，具有优越的水稻种植条件，占河南省水稻生产面积的85%左右，是河南省水稻主产区。豫南稻区具有丰富的特种稻种质资源[6]，但目前有关特种稻的研究多限于有色稻、香稻和糯稻等的单一性状，而对聚合种皮色泽、香味和糯性等2种或2种以上特殊性状的特种稻种质资源研究较少，同时结合产量因素等农艺性状对特种稻种质进行综合评价的研究也较少。因此，本研究利用主成分分析法，对豫南稻区聚合多个特殊性状特种稻种质的农艺性状和矿质元素含量进行综合分析评价，以期筛选出产量和功能营养特性俱佳的特种稻资源，为豫南稻区特种稻种质资源创新研究和利用提供新品种(系)和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为信阳农林学院水稻研究所搜集，经常规杂交和多代严格选择而创制的特种稻种质。12个特种稻品种(系)中，黑籼12、红香1号和红水晶为籼型常规稻；河南黑粳为粳型常规稻；黑宝糯为籼型糯稻，其余为粳型糯稻(表1)。

表1 豫南特种稻品种(系)种质类型及外观特性Table 1 The type of germplasm and appearance characteristics for special rice varieties (lines) in Southern Henan

1.2 试验设计

试验于2019年在信阳市太阳坡寨农林实习场进行，土壤质地为水稻土，pH值为6.7，有机质为28.37 g·kg-1，全氮为1.25 g·kg-1，速效磷为15.32 mg·kg-1，速效钾为138.25 mg·kg-1。2019-04-20播种育秧，2019-05-20插秧，单本移栽，行株距为30 cm×20 cm，每个品种种植20 m2，田间肥水和病虫害管理同常规大田。2019-10-10水稻收获后置于阴凉通风处，按照常规方法进行考种，测定水稻株高、分蘖数、穗长、结实率和千粒质量等农艺性状。稻谷经6个月时间的水稻子粒理化性质稳定后，进行稻米矿质元素含量检测。

1.3 稻谷外观特性及稻米矿质元素含量测定

水稻收获后，随机选取成熟稻谷50粒左右，使用稻米外观品质检测仪(JMWT 12，东孚久恒，北京)对子粒粒长和粒宽进行测定，使用游标卡尺测定粒厚，10次重复，取平均值。使用稻谷精米检测机(JGMJ 8098，嘉定粮油，上海)对稻谷脱壳，使用体视显微镜(Stemi 508,Zeiss,Germany)对稻谷[JX1]、糙米及其横截面进行拍照观察。稻米矿质元素含量由农业农村部农产品质量监督检验测试中心(郑州)进行测定，其中铜、锌、铁、钾、钙和镁含量按照GB 5009.268—2016方法测定，硒含量按照GB 5009.93—2017方法测定。

1.4 香味基因Badh2扩增测序

采用SLS法提取特种稻叶片全基因组DNA，根据香味基因Badh2第2外显子和第7外显子序列，分别设计扩增引物(表2)。PCR扩增体系为50 μL：2×Taq MasterMix 25 μL，正反引物(10 μmol·L-1)各2 μL，DNA模板1 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环，72 ℃终止延伸5 min。试验所用引物和PCR产物测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

表2 本试验所用引物Table 2 Primers used in this study

1.5 数据分析

使用Excel 2007软件进行数据统计和处理，使用R语言Vegan包进行主成分分析,并进行主成分综合得分评价。主成分系数为主成分载荷矩阵中各主成分载荷向量除以各主成分相对应的特征值的算术平方根，根据因子得分计算各主成分得分[7-8]。

2 结果与分析

2.1 豫南特种稻稻米外观特征分析

如图1所示，对稻米外观特性进行观察，12个特种稻品种(系)均为有色稻，其中黑籼12、黑香糯193、上海黑糯选4、上海黑糯、上海黑糯选2、黑糯2、河南黑粳、黑宝糯和黑香糯193-2为黑米；红香1号和红水晶为红米；鱼绿1号为绿米。其中，黑籼12、红香1号、红水晶和河南黑粳胚乳也具有较深的颜色。黑籼12、红香1号、红水晶和黑宝糯子粒粒长较长，属于籼型稻；其余8个品种(系)属于粳型稻。

2.2 豫南特种稻主要农艺性状分析

对豫南特种稻主要农艺性状测定如表3所示，不同品种(系)间主要农艺性状存在较大差异。供试的12个材料中，株高变化为93.5～135.2 cm，其中红香1号、上海黑糯选4和上海黑糯选2株高较高，达到130 cm以上。12个特种稻平均分蘖数为15.1，而红水晶分蘖数最少，只有9.2个；由于品种(系)间既有籼稻又有粳稻，故穗长变化幅度较大，为15.2～26.0 cm；结实率较高的品种(系)为上海黑糯选4、黑香糯193、河南黑粳、上海黑糯和上海黑糯选2，结实率均在90%以上，而红水晶结实率最低，只有68%；不同特种稻千粒质量变化区间为17.0～23.8 g，平均20.3 g，其中千粒质量最高的为红水晶，最低的为黑宝糯。

1～12为编号也对应表1中12个特种稻品种(系)。下同。标尺：1 mm。1～12 avenose;and are 12 varieties (lines) of special rice in Table 1 too.The same as below.Scale bar:1 mm.图1 豫南特种稻稻谷、糙米和横切面外观Fig.1 The appearance characteristic of grain,brown rice and cross section for special rice in Southern Henan

表3 豫南特种稻主要农艺性状分析Table 3 Analysis of main agronomic traits of special rice varieties in Southern Henan

2.3 豫南特种稻矿质元素含量分析

12个特种稻品种(系)稻米中矿质元素含量测定如表4所示。K含量变化幅度为2 410.5～3 862.0 mg·kg-1，除2个红米材料外，其余特种稻中K含量普遍较高，均在3 000 mg·kg-1以上；12个特种稻中，Ca含量变幅范围为161.5～384.0 mg·kg-1，其中黑香糯193、上海黑糯选2和鱼绿1号中Ca含量较高，均达到300 mg·kg-1以上；特种稻中，平均Zn含量为18.5 mg·kg-1，其中Zn含量在20 mg·kg-1以上的品种(系)有黑香糯193、黑糯2和河南黑粳；Fe含量最高的品种(系)为上海黑糯选2，达到21.90 mg·kg-1，最低的为鱼绿1号，只有6.50 mg·kg-1，特种稻中平均Fe含量为9.2 mg·kg-1。

表4 豫南特种稻稻米中矿质元素含量分析Table 4 Analysis of contents of mineral elements in special rice varieties in Southern Henan mg·kg-1

2.4 豫南特种稻香味基因Badh2序列分析

使用12个特种稻品种(系)DNA分别分析特异性扩增香味基因Badh2第2外显子和第7外显子序列，并与非香水稻品种日本晴(Nipponbare,Nip)序列进行比对。结果表明，12个特种稻品种(系)在第2外显子上均未发生突变；而黑香糯193、黑糯2、鱼绿1号、河南黑粳和黑香糯193-2在第7外显子上有8 bp碱基缺失和3个SNP(图2)。表明这5个特种稻品种(系)中香味基因Badh2存在变异，使水稻表现出香味。

2.5 豫南特种稻性状主成分分析及综合评价

为研究特种稻主要农艺性状和矿质元素含量的综合表现，对株高、分蘖数、穗长、结实率、千粒质量和K，Ca，Mg，Cu，Zn，Fe，Se 12个指标进行主成分分析。如表5所示，前5个主成分的累计贡献率达到87.58%，基本包含了5个农艺性状和7种矿质元素含量的所有信息。第1主成分特征值为3.780，贡献率为31.500%，是最重要的主成分，主要反映了穗长、分蘖数和K含量，三者载荷值分别为-0.398，0.381和0.457；第2主成分特征值为2.404，贡献率为20.031%，主要反映了株高和Cu，Fe含量，其载荷值分别为-0.411，-0.457和-0.417；第3主成分的代表指标为Se含量(载荷值为0.515)，其特征值为1.867，贡献率为15.558%；第4主成分的代表指标为千粒质量和Zn，Mg含量，三者载荷值分别为0.479，0.534和-0.504，其特征值为1.479，贡献率为12.328%；第5主成分主要反映了结实率(载荷值为0.545)和Ca含量(载荷值为-0.439)，其特征值为0.979，贡献率为8.160%。

表5 豫南特种稻主要性状主成分的特征值、贡献率、累计贡献率和成分载荷矩阵Table 5 Eigenvalues,variance contribution rates,cumulative contribution rates and rotated component matrix of the principal components of special rice varieties in Southern Henan

以农艺性状和矿质元素含量的12个指标的主成分系数计算各主成分得分(表6)，以不同特征值的特征值贡献率为加权系数，按照公式

表6 豫南特种稻农艺性状和矿质元素含量主成分综合评价Table 6 Principal component comprehensive evaluation of main agronomic traits and mineral element in special rice varieties in Southern Henan

F=主成分1特征值/(5个主成分特征值之和×主成分1得分+……+主成分5特征值)/5个主成分特征值之和×主成分5

建立豫南特种稻主要农艺性状及矿质元素含量的综合评价函数F=0.358 7F1+0.228 7F2+0.177 7F3+0.140 8F4+0.093 2F5。计算各品种(系)的综合品质得分，并从高到低进行排序。根据综合得分对12个豫南特种稻资源进行综合评价。得分在0以上的品种按分值高低分别为黑糯2、河南黑粳、黑宝糯、鱼绿1号、黑香糯193和黑香糯193-2。

Nip：水稻品种日本晴；删除线：缺失碱基；灰色标记：突变碱基。Nip:Nipponbare;Dashes:deleted bases;The base mutations are marked by grey boxes.图2 豫南特种稻与日本晴Badh2基因第7外显子序列比对Fig.2 Sequence alignment of Badh2 exon 7 for special rice in Southern Henan and Nipponbare

3 结论与讨论

近年来，特种稻作为一种具有特殊利用价值的水稻品种类型而受到关注，对于特种稻功能营养品质的研究也逐渐深入。但由于特种稻多来源于地方种质，具有较强的地域性，在育种过程中一些株型差，茎秆高和抗性低等不良性状较难获得完全改良，与生产中大面积推广种植的“超级稻”相比，特种稻产量相对较低，较难进行大面积推广应用。研究表明，特种稻中花色苷、γ-氨基丁酸、赖氨酸、Ca、Fe、Zn和Se等矿质元素含量普遍高于白米对照[9]，黑色稻米中具有较高含量的花青素[10]。对信阳地区特种稻氨基酸含量检测发现，不同特种稻中氨基酸含量存在丰富变异，矮秆香稻丸中必需氨基酸的赖氨酸、杂环族氨基酸和芳香族氨基酸含量均相对较高[11]。本研究对特种稻株高、分蘖数、穗长、结实率、千粒质量和矿质元素含量等12个农艺性状和营养品质指标进行分析，由于涉及指标较多，因此利用主成分分析法，采用降维思路，将多个指标简化为相互独立的主成分[12]，构建了特种稻农艺性状和功能营养品质的综合评价函数，据此筛选出综合性状较好的品种黑糯2、河南黑粳、黑宝糯、鱼绿1号、黑香糯193和黑香糯193-2。而红水晶品种株高偏高，分蘖数和结实率均最低，采用此函数对其评分也是最低的。因此，本研究采用的主成分综合评价方法，消除了不同指标间产生的相互影响，评价结果较为可靠。

相比于香味和糯性，特种稻稻米色泽是区别于普通稻米最直观的一种表型。较早研究有色稻米的裘凌沧等[13]结果表明，紫米和红米中Fe，Mn和Zn含量较为丰富。傅瑶等[14]研究表明，黑米中P，K，Fe，Mg，Mn和Cu含量高于白米，而红米中P，Ca，Mg，Zn，Fe，Mn和Cu含量比白米高；熊艳珍等[15]对7篇文献中的黑米和白米矿质元素含量综合分析，发现黑米的微量元素含量，尤其是Fe和Zn含量均显著高于白米。本研究的特种稻品种(系)Ca含量普遍较高。据报道，高钙天然配方米品种云光109的Ca含量为166 mg·kg-1[16]，而黑香糯193、上海黑糯选2和鱼绿1号稻米Ca含量均超过350 mg·kg-1，是云光109稻米的2倍以上。因此，这3个特种稻可认为是“高钙米”，其中鱼绿1号和黑香糯193综合得分排名分别为第4和5位，二者的综合性状表现也较好。GRAHAM等[17]对939个水稻种质资源研究发现，稻米Fe含量为7.5～24.4 mg·kg-1，平均为12.1 mg·kg-1。本试验的12个特种稻种质中，上海黑糯选2的Fe含量达21.9 mg·kg-1，而国际水稻所培育的富铁水稻IR 164中Fe含量超过25 mg·kg-1，比普通水稻高出60%以上。因此，上海黑糯选2可认为是一种“富铁米”。普通种植稻米中Zn含量普遍低于14 mg·kg-1[18]，李琬等[19]对黑龙江省137个水稻资源进行测定，发现Zn含量变异区间为10.92～25.47 mg·kg-1，平均为16.15 mg·kg-1。本研究中，黑香糯193和黑糯2稻米中Zn含量均超过24 mg·kg-1，可认为是一种“富锌米”，而黑糯2的综合得分排名第1，黑香糯193排名第5，二者的综合表现均较好。

香稻在蒸煮过程中散发的怡人香气，可大大提高稻米食用口感品质。目前，关于水稻香味基因Badh2的变异位点已报道有17个之多，但其主要变异发生在第2外显子上7 bp碱基缺失或第7外显子上8 bp碱基缺失和3个SNP[20-21]。本研究对上述2个位点的检测结果显示，12个特种稻资源中，有5个品种的香味基因Badh2发生变异，且全部为第7外显子上的8 bp碱基缺失和3个SNP位点。表明这12个特种稻香味基因的主要变异均在第7外显子上。彭波等[22]对豫南地区16个香稻品种进行检测分析，发现有4个属于第2外显子突变，5个属于第7外显子突变型。王丰等[23]研究的16个香稻资源中，均为第7外显子发生突变；姜达等[24]对27个香稻品种分析显示，在20个品种的第7外显子检测到突变，未发现第2外显子序列的改变。本研究筛选出的5个香型特种稻品种(系)黑香糯193、黑糯2、鱼绿1号、河南黑粳和黑香糯193-2的综合得分均在0以上，排名在12个材料中的前6位，表明选育的香型特种稻综合性状均较好。在品种(系)选育过程中，发现上海黑糯选4和上海黑糯也具有香味，但对香味基因的2个主要位点分析却未检测到变异，表明这2个品种可能在Badh2基因的其他位点发生变异。

有研究认为，香味、有色种皮、巨胚、甜味和糯性等单一特殊性状，或2～3个特殊性状的聚合，可对稻米中赖氨酸含量及Fe，Zn和Ca含量的提高产生一定的增加效应[9]。本研究鉴定的“高钙米”黑香糯193、鱼绿1号，“富锌米”黑香糯193和黑糯2均聚合了有色种皮、糯性和香味等3种特殊性状。韩龙植等[25]认为，巨胚、甜味、有色种皮和香味等2个以上特殊性状的创新型特种稻可显著增加蛋白质、赖氨酸、维生素和矿质元素Ca，Fe，Zn，Se等含量，提高水稻种质营养保健功能。本研究采用主成分综合评价法筛选出的得分前6个品种中，黑糯2、鱼绿1号、黑香糯193和黑香糯193-2具有有色种皮、糯性和香味3种特殊性状；具有2种特殊性状的为河南黑粳(有色种皮和香味)和黑宝糯(有色种皮和糯性)。因此，本试验中多个特殊遗传性状的特种稻品种(系)的选育和筛选方法，可为豫南稻区特种稻种质资源创新和利用研究提供材料和理论基础。