结核感染T 细胞斑点试验在肺结核合并糖尿病诊断中的作用

王喜泰，陈创坤，郑智鑫，陈挺阳

汕头市澄海区人民医院感染科，广东汕头 515800

肺结核是临床上比较棘手的疾病之一， 我国是全球结核病发病率较高的一个国家，疫情十分复杂。 研究指出[1-3]结核病的危险因素较多，比如男性、饮酒、吸烟、肾脏疾病、体重过轻、家庭接触、糖尿病等。 按照国际糖尿病联盟公布的资料[4]，发现全球20～79 岁成人中糖尿病患病率接近10%。 一些报道与临床实践中发现[5]，临床收治的肺结核患者中部分患者合并糖尿病， 导致其临床诊断难度增加，甚至会干扰诊断结果，这为临床诊断方法的选择提出了难题。 过去诊断结核病的方式主要有结核菌素试验（TST）检查、痰抗酸杆菌涂片、结核感染T 细胞斑点试验（T-SPOT.TB）、结核菌培养及结核抗体检测等，其中结核菌培养是诊断结核病的金标准，但其细菌培养速度缓慢，无法满足及时、快速诊断的要求[6]；结核抗体检测准确度虽然比其他诊断方式高，但费用高昂，技术要求高，对于一些家庭条件差、医院设施差的地方难以广泛开展[7]；T-SPOT.TB 诊断以抗原特异性T 细胞反应作为理论基础，价格合适，有一定的推广应用条件。 为了进一步分析肺结核合并糖尿病诊断中应用T-SPOT.TB 的作用， 该院就2018 年5 月—2020年5 月收治的肺结核合并糖尿病患者30 例与单纯糖尿病未合并肺结核患者30 例进行了对照研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选择该院收治的肺结核合并糖尿病患者30例作为观察组， 同期收治的单纯糖尿病未合并肺结核患者30 例作为对照组。 对照组：男17 例、女13 例；年龄30～78 岁，平均（45.84±10.22）岁；糖尿病病程1～18年，平均（7.66±1.52）年。 观察组：男16 例、女14 例；年龄36～78 岁，平均（46.99±10.16）岁；糖尿病病程1～19年，平均（7.83±1.72）年；初治肺结核25 例、复治肺结核5 例。两组患者年龄、性别、病程比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。此外，该研究经该院医学伦理委员会批准。

诊断标准： 肺结核诊断标准参考中华医学会结核病学分会制定的有关于《肺结核诊断和治疗指南》中的肺结核标准[8]。 糖尿病诊断标准参考2012 年美国糖尿病协会（ADA）制定的《ADA 糖尿病诊疗指南》中有关于糖尿病标准[9]：糖化血红蛋白≥6.5%，或空腹血糖不低于7.0 mmol/L；或75 g 口服葡糖糖耐量试验2 h 血糖不低于11.1 mmol/L。

纳入标准：观察组满足肺结核标准与糖尿病标准；对照组满足糖尿病标准且排除肺结核；临床资料完整；签署知情同意书。 排除标准：依从性差者；合并严重心肝肾病变者；合并恶性肿瘤者；合并硅沉着病者；合并HIV 感染者；妊娠期或哺乳期；精神疾病者；合并免疫系统疾病者。

1.2 方法

1.2.1 痰抗酸杆菌涂片诊断 抽取早晨、夜间、即时痰液3 份，留取痰样本放在特制痰盒，用折断的竹签挑取痰样本中脓样、干酪样或可疑部分0.05～0.1 mL，放置在载玻片正面靠右2/3 处， 均匀涂抹为卵圆形痰膜， 面积10 mm×20 mm。 痰膜朝上静置， 自然干燥后染色及镜检。 干燥的痰涂片经火焰固定5 s，往痰膜滴入石碳酸复红溶液，将痰膜盖满，然后加热，直到蒸汽出现后停止，加热期间勿让染色液沸腾。 染色5 min，以水冲净，加入5%盐酸乙醇脱色液，直到完全去掉红色，加入亚甲蓝复染30 s，以水冲洗、晾干、读片。 读片时按照从左往右原则，完成这边读片时，就应纵向往下转换视野，从右往左观察，以此类推。 读片时按照《中国结核病防治规划实施工作指南》 中的有关规定转换300 个视野观察，连续300 个视野观察均无检出抗酸杆菌，判断为阴性；转换300 个视野时，菌数1～8 条为抗酸杆菌阳性（+）；转换100 个视野时，菌数3～9 条为抗酸杆菌阳性（1+）；转换10 个视野时，菌属1～9 条为抗酸杆菌阳性（2+）； 在每个视野均可显示1～9 条菌数则为为抗酸杆菌阳性（3+）[10]。

1.2.2 TST 诊断 采用结核菌纯蛋白衍生物注射液 （生产批号20170211）0.1 mL，于左侧前臂内侧以孟都法注射，让注射部位形成皮丘。 待72 h，观察有无硬结，有硬结则测量硬结的直径，并进行判断。 硬结直径＜5 mm 评估为阴性（-），直径5～9 mm 评估为弱阳性（+），直径10～19 mm 评估为阳性（++），直径不低于20 mm 评估为强阳性（+++）[11]。

1.2.3 T-SPOT.TB 诊断 选择T-SPOT.TB 试剂盒（生产批号20170807）检测，严格按照仪器说明书执行。 先用肝素钠抗凝管收集外周静脉血5 mL，常规分离后，根据密度梯度离心制备单个核细胞，其中离心参数包括半径1 cm、速率7 000 r/min、时间10 min。 然后实施洗涤，将内源性γ 干扰素除去。 获取的样本加γ 干扰素抗体平板内，每孔100 μl。于阳性对照孔内加入5 mg/L 植物血凝素5 μl，阴性对照孔不加任何刺激素。 实验孔内加入蛋白培养液10 与早期分泌靶性抗原6， 并将最终浓度控制在5 mg/L。 取细胞混悬液制备为1∶5 细胞稀释液，计数，并加样孵育，时间16～20 h，培养结束，洗板，加检测抗体、亲和素各孵育1 h，显色后再洗板，晾干后镜下检查与计数斑点情况，做好记录。 T-SPOT.TB 诊断标准参考如下：阴性对照品斑点数不超过5，且A 或B 孔斑点与阴性斑点数差值不低于6，或阴性对照品斑点数不低于6， 且A 或B 孔斑点数不低于2 倍阴性对照斑点数为阳性；若A 孔与B 孔斑点数不满足阳性标准，但阳性对照反应良好为阴性[12]。

1.3 观察指标

将临床病理诊断结果作为标准， 比较两组3 种检查方式相关结果，予以统计学分析。

1.4 统计方法

选择SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析，计数资料的表达方式为[n(%)]，采用χ2检验， P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 T-SPOT.TB 诊断两组患者符合率情况

T-SPOT.TB 诊断两组符合率分别为90.00%、93.33%，差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表1。

表1 T-SPOT.TB 诊断两组符合率情况比较[n(%)]

2.2 TST 诊断两组患者符合率情况

TST 诊断两组符合率分别为56.67%、83.33%，差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表2。

表2 TST 诊断两组符合率比较[n(%)]

2.3 痰抗酸杆菌涂片诊断两组患者符合率情况

痰抗酸杆菌涂片诊断两组符合率分别为30.00%、96.67%，差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表3。

表3 痰抗酸杆菌涂片诊断两组患者符合率比较[n(%)]

2.4 3 种诊断方式符合率比较

统计学分析显示T-SPOT.TB 诊断观察组符合率明显高于其他两种检测方法，差异有统计学意义（P＜0.05），但在诊断对照组符合率上3 种检测方法差异无统计学意义（P>0.05）。 见表4。

表4 3 种诊断方式符合率对比[n(%)]

3 讨论

肺结核与糖尿病均为全球公共卫生问题， 按照世界卫生组织在2011 年的报道显示[13]，全球结核病发病人数与死亡人数分别为870 万、140 万， 而近几年肺结核病发病率与病死率居高不下， 严重影响患者的正常生活、工作及学习，需引起重视。 多项研究发现[14]，糖尿病是肺结核独立危险因素之一， 同时在多项荟萃分析中指出糖尿病患者罹患肺结核的相对危险达到3.11。糖尿病患者更易发生肺结核的原因可能和血糖控制不良有关，加上肺结核合并糖尿病临床症状、影像学不典型，容易误诊，为此寻求一种早期快速诊断肺结核合并糖尿病的方式十分关键。 肺结核传统诊断方式较多，如涂片法、细菌培养法、结核抗体法、影像学检查、红细胞沉降率等，但都或多或少有明显缺陷，应用有局限性。T-SPOT.TB 检查作为酶联免疫斑点试验基础上进展出的结核杆菌检测新技术，在一些地区逐渐推广起来，证实在肺结核及其合并疾病诊断中有不错的价值。

该次就该院收治的肺结核合并糖尿病与单纯糖尿病患者进行T-SPOT.TB 诊断研究， 同时和传统诊断方式TST 诊断、痰抗酸杆菌涂片诊断进行对照，将临床病理结果作为标准， 最终发现T-SPOT.TB 诊断肺结核合并糖尿病、 单纯糖尿病的符合率为90.00%与93.33%，TST 诊断则为56.67%与83.33%，痰抗酸杆菌涂片则为30.00%与96.67%，比较发现在肺结核合并糖尿病上TSPOT.TB 诊断符合率明显高于TST 诊断、 痰抗酸杆菌涂片（P＜0.05）。 该研究结果与同类研究相似，刘立虎等学者[15]对104 例呼吸科收治的患者研究，其中确诊为肺结核合并糖尿病的54 例为试验组，其余为未合并结核病的糖尿病是对照组， 实施TST、T-SPOT.TB 及痰抗酸杆菌涂片检查，发现T-SPOT.TB 检查灵敏度为90.7%，显著高于TST 的55.6%、痰抗酸杆菌涂片检查的24.1%（P＜0.05）。 TST 作为诊断肺结核辅助试验，是检测机体有无结核变态反应的方式，价格低廉、操作简单，满足国情需求，但受到主观因素、卡介苗接种、机体免疫水平等干扰，会有假阳性或假阴性，无法排除非结核分枝杆菌感染，特别是糖尿病血糖较高水平下，导致免疫系统受损， 合并肺结核后血清学检测与TST 检测出现假阴性几率更高。 痰抗酸杆菌涂片尽管可作为金标准，但其培养周期较长， 痰涂片阳性率比单纯肺结核阳性率高， 可受到主观因素与医院条件限制， 阳性率普遍不高。 T-SPOT.TB 诊断可根据γ-干扰素释放试验（IGRAs）原理，用酶联免疫斑点技术完成检测，而IGRAs可检测全血或分离后的全血中单核细胞于结核分枝杆菌上的特异性抗原刺激下的γ-干扰素含量， 从而判断被试是否有结核分枝杆菌感染。 越来越多的研究报道发现IGRAs 对潜伏性结核感染与活动性肺结核诊断有良好的特异度与灵敏度， 受到了广泛关注。 此外，TSPOT.TB 诊断以结核分枝杆菌特有基因片段（RDI 基因序列编码ESAT-6、CFP-10 两种蛋白质）作为特异性抗原刺激特异性T 淋巴细胞，产生IFN-γ，经测定其含量，可诊断结核分枝杆菌感染情况， 从而避开普遍缺失前述蛋白的BCG 与非结核杆菌影响， 因这两种蛋白没在卡介苗与绝大部分非结核分枝杆菌基因组中编码，为此有良好的特异性。

综上所述， 肺结核合并糖尿病诊断中应用结合感染T 细胞斑点试验检查，相比痰抗酸杆菌涂片、结核菌素试验检查可进一步提高诊断符合率。