黄连肉桂对自发性2型糖尿病小鼠胆汁酸代谢、肠上皮Occludin蛋白表达及小肠形态结构改变的影响

穆国华 赵宗江 孟繁章 赵进喜

2型糖尿病(Type 2 Diabetesmellitus，T2DM)近几年逐渐成为危害我国人民健康的主要慢性代谢性疾病之一，发病率逐年上升且年龄呈下降趋势。全球约4.15亿的糖尿病患者中，约有90%为T2DM，做为人口大国的我们亦是T2DM发病最多的国家之一[1]。近几年来研究发现，胆汁酸(bile acids，BA)的代谢与T2DM的防治有着密不可分的关系，其可参与糖脂的代谢，其主要机制与BA可以激活法尼醇X受体(farnesoid X receptor，FXR)进而促进成纤维细胞生长因子19(fibroblast growth factor 19，FGF19)分泌以及活化G蛋白偶联胆汁酸受体5(G protein cooupled bile acid receptor 5，TGR5)促进肠道L细胞分泌胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide，GLP-1)有关[2-3]。肠道的选择性屏障与代谢性疾病的发生紧密相连，对维持人体代谢平衡起着重要的作用[4-5]。Occludin蛋白对肠上皮紧密连接至关重要，Occludin蛋白缺失引起肠道黏膜破坏，研究证实，T2DM伴随着肠道肠屏障功能的损害，而肠道完整性由紧密连接控制[6]。

T2DM属于中医“消渴病”的范畴，明何柏斋《医学管见》提出消渴的病机为“造化之机，水火而已，……交则为既济，不交则为未济。消渴证，不交而火偏盛也”，此理论为黄连、肉桂治疗T2DM提供了有力的理论基础。研究证实，黄连、肉桂可以有效的改善糖尿病的高血糖状态，改善胰岛细胞功能，延缓糖尿病的并发症发病进程[7-8]。本实验研究黄连肉桂是否通过调节自发性2型糖尿病(diabetes mouse，db/db)小鼠胆汁酸代谢及上调肠Occludin蛋白的表达改善肠道屏障功能，降低小鼠血糖及改善胰岛素抵抗状态，为其进一步临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

6周龄SPF级雄性自发性2型糖尿病db/db小鼠(C57BLKS)30只以及6只同周龄雄性同窝野生型db/m小鼠(购自常州卡文思实验动物有限公司，合格证号：SCXK(苏2016-0010)，db/m小鼠体重20～25 g，db/db小鼠体重35～40 g，于中国中医科学院中医基础理论研究所SPF级动物房饲养。

1.2 药物及试剂

二甲双胍片，规格0.5 g×20片，商品名：格华止，购自中美上海施贵制药有限公司。黄连、肉桂为中药配方浸膏：黄连及肉桂购自北京康美制药有限公司，由北京中医药大学科研实验中心进行含量测定，并制成浸膏，均符合2010版药典合格标准。

1.3 仪器

血糖试纸：稳豪型血糖试纸，产品标准证号：YZB/USA 0659- 2010,强生(上海)医疗器材有限公司。1.8 mL外旋冻存管，购自corning公司。50 mL离心管，购自corning公司。磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒(DP712)，购自TIANGEN公司；血糖仪：强生稳豪型血糖仪(ONETOUCH UltraEasy),强生(上海)医疗器材有限公司。高速冷冻离心机：安徽中科中佳，型号KDC-140HR；分析仪：Thermo公司Q exactive高分辨质谱检测系统，配有电喷雾(ESI)离子源和Xcalibur工作站。

1.4 分组

所有小鼠按3只/笼，饲养于独立通气笼系统内，室温(24±2)℃，12小时光照维持，昼夜循环，自由摄食、饮水。普通饲料适应性喂养1周后，测量db/db糖尿病小鼠尾尖静脉血糖，选取3次空腹血糖平均值>13 mmol/L[9](禁食6小时，间隔1天)的db/db小鼠30只，随机分为模型组、二甲双胍组、黄连组、肉桂组及黄连肉桂组，每组6只；以同龄的db/m小鼠6只作为空白对照组。

1.5 给药方法

中药干预药物为黄连、肉桂，西药干预药物为二甲双胍。以上药物的成人剂量为二甲双胍1500 mg/60 kg，黄连∶肉桂=10∶1，小鼠剂量的换算方法参考徐叔云教授主编的《药理实验方法学》，人和动物间按体表面积对剂量进行换算：小鼠剂量(mg/kg)=9.1×人的临床剂量(mg/kg)。采取灌胃的方式进行给药，空白组及模型组仍给予纯净水，适应性饲养1周后，开始药物干预，药物干预时间为8周。

1.6 指标检测

1.6.1 血糖及胰岛素检测 在第8周时，采用血糖仪测定尾静脉血，记录小鼠血糖水平；最后摘除眼球取血离心，生化法测定小鼠空腹胰岛素水平。

1.6.2 液相色谱法检测小鼠胆汁酸代谢情况 采用提尾反射法收集小鼠粪便标本，使用无菌EP管收集标本，每管采集3粒粪便，标记后放入-80℃低温冰箱保存，经过样品提取纯化后，基于液相色谱分析法分析各组小鼠粪便中不同的BA含量。

1.6.3 蛋白免疫印迹法检测小鼠回肠Occludin蛋白量的表达 取3只小鼠少量超低温冰箱中的小鼠回肠粉碎组织加入RIPA裂解液匀浆后裂解,随后于4℃冷冻离心机下12000 r/min离心10分钟，取上清液使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，对蛋白进行变性，制备SDS-PAGE上样缓冲液，经电泳、转膜、抗体孵育、化学发光、显影后，采用目的条带与内参蛋白条带光密度比值作为结果进行统计分析。

1.6.4 电镜观察小鼠小肠超微结构改变 取少量小肠组织，室温下新锇酸固定2小时，蒸馏水冲洗3次，2分钟/次，后经果脱水、包埋，超薄切片后于透射电镜下观察小肠黏膜超微结构的改变。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 黄连肉桂对db/db小鼠血糖、胰岛素监测

药物干预前，db/db小鼠各组的血糖无统计学差异(P>0.05)，在第8周分别对各组小鼠的血糖进行检测，对第8周各组小鼠的血糖进行分析，模型组小鼠血糖明显高于其他组(P<0.05)，黄连组与黄连肉桂组小鼠血糖值明显优于双胍组(P<0.05)，中药各组相比黄连、黄连肉桂组小鼠血糖值优于肉桂组(P<0.05)。正常组空腹胰岛素明显低于其余各组小鼠(P<0.05)，双胍组、黄连组、黄连肉桂组小鼠空腹胰岛素均明显低于模型组(P<0.05),且三组中黄连肉桂组空腹胰岛素均值最低。如表1所示。

表1 黄连肉桂对各组db/db小鼠第8周血糖及胰岛素情况鼠只=6)

2.2 黄连肉桂对db/db小鼠胆汁酸代谢影响

用药组中，肉桂组胆酸(cholic acid，CA)含量较正常组及模型组明显升高(P<0.05)，黄连肉桂组CA含量较正常组及模型组明显升高(P<0.05)；各组小鼠代谢中鹅去氧胆酸(chenodeoxy cholic acid，CDCA)含量相比，黄连肉桂组较模型组明显升高(P<0.05)；熊去氧胆酸(Ursodeoxy cholic acid，UDCA)在各组小鼠粪便中含量相比较，黄连组比模型组明显下降(P<0.05)，黄连肉桂组较模型组及双胍组明显降低(P<0.05)。如表2所示。

表2 黄连肉桂对各组小鼠不同胆汁酸代谢情况(鼠只=6，ng/mg)

2.3 黄连肉桂对db/db小鼠肠Occludin蛋白表达的影响

与正常组对比，模型组Occudin含量明显减少(P<0.05),黄连肉桂组与模型组相比Occudin含量明显明显增加(P<0.05)，双胍组Occudin含量较正常组及黄连肉桂组明显减少(P<0.05)。余各组间无明显统计学差异。如图1、表3所示。

图1 各组小鼠肠组织Occludin蛋白表达情况

表3 蛋白免疫印迹法检测各组小鼠肠Occludin蛋白表达情况(鼠只

2.4 黄连肉桂对各组小鼠肠道超微结构改变

正常组小鼠肠黏膜表皮微绒毛排列均匀整齐，边界清晰，长度一致，无不规则脱落情况，细胞无明显改变，细胞间隙均匀，大小正常。模型组小鼠肠粘膜表皮微绒毛排列稀疏、边界欠清，长短不一，形态不规则，有脱落融合现象，肠黏膜上皮细胞间紧密连接间隙增宽，结构模糊，说明肠黏膜紧密连接的超微结构被破坏。三组中药组小鼠肠黏膜结构清晰完整，微绒毛排列整齐、形态正常，大小均匀且连接紧密，其中黄连肉桂组排列较其他两中药组及模型、双胍组更为紧密均匀，细胞内外结构更为完整，细胞间隙均匀，大小正常，肠黏膜紧密连接的超微结构较为完整，与正常组最为接近。如图2所示。

图2 扫描电镜下各组小鼠小肠超微结构的改变

3 讨论

黄连味苦性寒，归心、胃、肝、大肠经，其主要功效为清热燥湿、泻火解毒，肉桂辛、甘、热，归心、肝、脾、肾经，具有补火助阳、散寒止痛、温经通脉和引火归源的功效，王好古谓其“补命门不足，益火消阴”；两者配伍，一上一下，一寒一热，下可温补肾阳、引火归原，上可泻火解毒、益阴清热。近几年，诸多研究证实黄连肉桂同用可以有效的改善T2DM患者高血糖状态，改善胰岛细胞功能，延缓糖尿病的并发症发病进程[10]。现代药理学研究证实，黄连素及油桂皮醛均具有抗溃疡、止泻、促进胃肠蠕动及促进胆汁分泌等功效,且两者配伍后降糖效果明显[11-12]。黄连肉桂用于T2DM的治疗有着充分的中医学理论依据和药理学研究基础。

BA的代谢与T2DM的关系是目前研究的热点，BA在人体肝脏中主要由胆固醇在肝细胞中通过复杂的类固醇羟基化及侧链氧化步骤而合成，BA主要通过经典途径、替代途径两条途径生成，分别产生CA和CDCA，在小鼠体内同时还可以产生鼠胆酸(muricholic acid，MCA)和UDCA作为主要胆汁酸[13-15]。BA参与糖脂代谢的调节，主要是通过FXR和TGR5来实现[16]，FXR可以促进细胞生长因子成纤维生长因子15/人直系同源19(fibroblast growth factor 15/19，FGF15/19)的分泌，BA-FXR介导的肠FGF15/19与肝成纤维细胞生长因子受体4/可罗索β蛋白结合，从而促进肝糖原合成和降低血糖，同时还可以减轻T2DM小鼠的体重增加、葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗[17]，TGR5可以促进肠道L细胞分泌GLP-1来调节血糖[18]。本实验研究显示，黄连肉桂可以促进db/db小鼠CA和CDCA的分泌，同时减少UDCA的含量，有研究证实，不同BA对FXR的激活作用不尽相同，CDCA是FXR最有效的胆汁酸配体，CA次之[19]，而UDCA对FXR受体具有拮抗作用[20]。

肠道屏障的完整性与人体的健康关系密切，肠道屏障的损伤可以引发诸多炎性因子及内毒素入血，进而导致许多代谢疾病的发生，肠道通透性改变，可以激活导致胰岛素抵抗的全身性炎症反应继而诱导T2DM的发生[21]。T2DM患者常伴有肠道完整性的损害，肠道屏障的完整性是否完好取决于紧密连接控制[22]，而紧密连接是由跨膜蛋白和胞质蛋白组成，Occludin蛋白为其中之一，Occludin蛋白是最早被发现的跨膜紧密连接蛋白[23]，研究证实，Occludin蛋白的丢失可以导致肠上皮紧密连接渗透通路的通透性增加，损害肠道屏障[24]。此次试验中，黄连肉桂可以有效提高db/db小鼠肠道Occludin蛋白的表达改善小肠通透性，提高小肠屏蔽功能。

本实验再次通过检测db/db小鼠的血糖、空腹胰岛素、胆汁酸代谢、肠道Occludin蛋白的表达及其对小肠形态结构的改变，探讨黄连肉桂改善db/db小鼠高血糖状态的作用机制，实验研究显示，黄连肉桂可以有效改善db/db小鼠高血糖状态，减少db/db小鼠空腹胰岛素分泌，其机制可能与其可以调节胆汁酸代谢、增加肠道Occludin蛋白表达改善肠道通透性有关，为黄连肉桂在临床的进一步应用提供了实验数据支持。