五味子乙素对博来霉素诱导小鼠肺纤维化的干预作用及机制研究

赵红舟 龙杞 刘肇恒 顾潇枫 庞庆禄 焦扬

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种慢性、炎症性、间质性肺疾病，具有进行性、不可逆转和致死性的特点。IPF在世界范围内的发病率正在逐年增加，从诊断到死亡的平均生存时间只有2～3年[1]，5年内的生存率不到40%[2]。近年来有研究发现吡非尼酮和尼达尼布等抗纤维化药物在改善IPF患者症状和延缓肺功能下降等方面具有一定作用，但是此类药物价格昂贵，而且其安全性尚未得到充分证明[3]。因此，研究IPF的发病机制和治疗方法，对于指导临床具有重要的意义。一般认为，特发性肺纤维化的形成机制包括肺泡上皮细胞损伤、氧化应激、炎症反应、细胞凋亡等，并在此基础上释放细胞因子等活性物质，刺激肌成纤维细胞增殖分化，促使肺成纤维细胞灶形成和胶原沉积，进而导致细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的大量合成，最终导致IPF[4]。

五味子为木兰科五味子的干燥成熟果实，其皮肉甘酸，核中苦辛，皆有咸味，五味具备，故名之。现代药理学研究表明五味子的成分主要源于木脂素类化合物，其中五味子乙素(Schisandrin B, Sch B)含量最高，现代药理研究发现，它具有保护中枢神经系统、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保肝等多种药理作用[5-8]。众多实验表明其能够升高细胞内超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)水平，抑制脂质过氧化反应，减少乳酸脱氢酶、丙二醛和活性氧的释放，并可直接清除自由基，发挥抗氧化作用[9]。通过文献整理回顾近年来关于五味子乙素对肺纤维化的基础研究可以发现，多是集中在从抗炎机制和抑制转化生长因子β1蛋白通路等角度为切入点，对于其抗氧化机制的干预研究未曾探讨。本实验从分析肺组织染色结果，以及相关的纤维化、氧化及抗氧化指标水平的改变，研究五味子乙素对博来霉素所致的小鼠肺纤维化的干预作用，从氧化应激与抗氧化的角度探讨五味子乙素治疗肺间质纤维化的作用机制，为临床治疗提供实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

C57BL6雄性小鼠24只，体重(20±2)g，购于北京维通利华动物技术公司，生产许可证号：SCXK(京)2016-0001。Sch-B(成都曼斯特生物科技有限公司，纯度>98%)、注射用盐酸博来霉素(Fresenius Kabi 6115292)、异丙醇(国药40064360)、无水乙醇(国药10009218)、TRIZOL(Invitrogen 10296028)、DEPC(MDL MD911875)、超纯琼脂糖(ABI-invitrogen 16500100)、SuperScript III Rt 逆转录仪(ABI-invitrogen 11752050)、SOD荧光定量PCR试剂盒(ABI-invitrogen 4472920)、血红素氧合酶(Heme oxygenase，HO-1)荧光定量PCR试剂盒(ABI-invitrogen 4472920)、羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)的含量 Elisa试剂盒(Dogesce DG94697Q-96T)、血8-异前列腺素(8- Isoprostaglandin，8-iso-PGF) Elisa试剂盒(Dogesce DG94697Q-96T)、台式高速冷冻离心机(THERMO LEGEND MICRO 21R)、分光光度计(THERMO Nanodrop lite)、移液器(Eppendorf)、荧光定量PCR仪(Applied biosystems Step One Software)、电泳仪(biorad Eps 300)、凝胶成像仪(biorad 2500)。

1.2 实验分组及干预方法

根据体重将24只小鼠随机分为空白组、模型组和Sch-B组，每组8只，先适应性喂养1周，然后在异氟烷麻醉的情况下，向模型组和Sch-B组小鼠气管内滴入1 mL博来霉素稀释液(含Bleo2.5 u)造模，空白组用同法滴入等量的0.9%氯化钠注射液。造模后第1天空白组和模型组小鼠每天按(0.01 mL/g)体重灌胃给予0.9%氯化钠注射液，Sch-B组小鼠每天按(100 mg/kg)体重灌胃给药，并测量体重变化，随时调整给药剂量，观察各组小鼠的精神及活动状态，14天后颈椎脱臼处死小鼠，每组随机抽取三只小鼠取其左肺制作石蜡切片，用于HE和Masson染色并进行镜下观察；其余肺组织于液氮中速冻后存于-80℃冰箱中，进行PCR和Elisa测定。

1.3 肺组织病理学观察

1.3.1 HE染色观察肺组织炎性程度 先将组织样本进行常规石蜡包埋，随后将组织切片放入载玻片上用40℃温水浸泡，随后将切片先后放入二甲苯和无水乙醇中浸泡10分钟，再将其置于85%的乙醇中浸泡5分钟，待充分水化后将组织样本切片用PBS溶液浸泡清洗，再用移液法吸取苏木素染色液，每个组织切片滴加100 μL，充分染色10分钟，。用1%的盐酸乙醇将组织切片分化，然后用双蒸水将组织切片冲洗干净。将促蓝液加入组织切片中，反蓝结束后先用清水进行清洗。向组织样本切片中加入伊红染液3分钟，染色完毕后，将组织切片分别用浓度为80%、95%以及无水乙醇进行梯度脱水。将脱水后的组织样本切片使用二甲苯浸泡8分钟，使用中性树胶封片，行显微镜下观察。肺泡炎性分级和评分标准参照Szapiel等方法[10]：0级：无肺泡炎，记0分；1级：轻度肺泡炎，镜下观察可见肺泡隔浸润增厚，但病变范围不超过全肺20%，肺泡结构未见明显改变，记1分；2级：中度肺泡炎，肺泡炎症病变面积占全肺的20%～50%，肺泡结构发生变化，记2分；3级：重度肺泡炎，病变范围超过全肺面积的50%，肺泡腔可见炎性细胞及红细胞，记3分。

1.3.2 Masson染色观察肺组织纤维化程度 先将组织样本进行常规石蜡包埋，再用4%多聚甲醛固定切片，脱蜡后入重铬酸钾—醋酸液1小时，水洗后染Regaud氏苏木素10分钟，再次充分水洗后，用2%盐酸酒精分化，流水冲洗至蓝黑色，加入1%丽春红酸性品红液染色5分钟；随后用蒸馏水进行水洗，加入1%磷钼酸水溶液媒染5分钟；然后入1%醋酸液分色1分钟，最后进行脱水处理并用中性树胶封固，行镜下组织观察。用Image-J软件对Masson染色结果进行图像处理分析，每张切片随机选取5个不重叠视野(×200)，评价肺纤维化程度，肺纤维化百分比=肺纤维化面积/肺组织面积×100%。

1.4 荧光定量PCR检测SOD、HO-1

取100 mg右肺组织加入1 mL的Trizol，电动匀浆，冰上反应30分钟后转移到1.5 mL无菌无酶EP管中。按照哺乳动物蛋白RNA提取试剂盒说明书提取各组总RNA并逆转录为cDNA，采用SYBR一步法荧光定量PCR试剂盒定量分析HO-1、SOD的表达。计算出样品的△CT值，以比较域值法将其与同一样本内参基因β-actin的△CT值做相应对比。

1.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定8-iso-PGF、HYP

先在酶标包被板上标准品准确加样50 μL，待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，然后再加待测样品10 μL。将样品加于酶标板孔底部，轻轻晃动混匀。再用封板膜封板后置37℃温育约30分钟，将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用，然后揭掉封板膜，弃去液体，甩干后每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次后拍干。每孔分别加入显色剂A50 μL和显色剂B50 μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色约10分钟，再加入终止液50 μL。以空白空调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组小鼠肺组织HE染色炎症评分比较

空白组小鼠肺组织结构正常，肺内结构清晰，肺泡间隔正常，无明显水肿、炎症或纤维化的表现；与空白组相比，模型组小鼠肺泡结构破坏明显，肺泡腔萎缩消失，肺泡间隔明显增厚，部分肺间质被纤维细胞替代，有明显的肺间质纤维化形成，并伴有炎性细胞浸润，肺泡炎症评分相比空白组明显升高(P<0.01)；与模型组相比，Sch-B组小鼠肺泡破坏和间隔增厚程度较轻，炎症细胞浸润较少，肺间质纤维化程度较轻，肺泡结构破坏程度和炎症程度明显减轻(P<0.01)，但Sch-B组的炎症程度和纤维化程度明显高于空白组(P<0.01)。见表1、图1。

图1 各组小鼠肺组织HE染色情况(×200)

2.2 各组小鼠肺组织Masson染色纤维化定量分析

空白组小鼠肺组织肺泡结构正常，蓝染区域较少；与空白组相比，模型组小鼠的肺组织肺泡结构明显被破坏，伴有肺泡融合，肺间质、支气管壁和肺泡隔被蓝染区域的面积明显增加，间质胶原增生沉积呈弥漫性、片状、束状样改变，有明显的胶原纤维形成，肺纤维化程度明显(P<0.01)；与模型组相比，Sch-B组小鼠肺组织肺泡结构破坏程度较轻，肺间质、支气管壁和肺泡隔被蓝染区域的面积有所减少，胶原纤维的形成和胶原沉积面积均减少(P<0.01)，但Sch-B组的胶原沉积面积明显高于空白组(P<0.01)。见下表1、图2。

图2 各组小鼠肺组织Masson染色情况(×200)

表1 各组小鼠肺泡炎性评分和肺纤维化面积百分比比较

2.3 各组小鼠SOD和HO-1水平测定结果

与空白组小鼠相比，模型组小鼠SOD和HO-1水平均明显降低(P<0.01)；与模型组相比，Sch-B组小鼠SOD和HO-1水平均明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，与空白组小鼠相比降低均不明显(P>0.05)，表明五味子乙素可以提高SOD和HO-1水平，具有抗氧化的作用，经干预后，Sch-B组小鼠的SOD含量和HO-1的相对表达量基本恢复至对照组水平。见表2。

表2 各组小鼠肺SOD和HO-1水平比较

2.4 各组小鼠HYP和8-iso-PGF水平测定结果

与空白组小鼠相比，模型组小鼠HYP水平明显升高(P<0.01)；与模型组相比，Sch-B组小鼠HYP水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)，表明五味子乙素能显著抑制HYP的合成，减少肺间质胶原的形成，从而减轻纤维化的程度，但Sch-B组与空白组相比HYP水平明显升高(P<0.01)。与空白组小鼠相比，模型组小鼠8-iso-PGF水平明显升高(P<0.01)；与模型组相比，Sch-B组小鼠8-iso-PGF水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)，表明五味子乙素能减少8-iso-PGF的含量，从而减轻氧化反应的程度,但Sch-B组与空白组相比8-iso-PGF水平明显升高(P<0.01)。见下表3。

表3 各组小鼠HYP和8-iso-PGF水平比较

3 讨论

目前研究认为肺纤维化的形成过程与肺泡上皮细胞的损伤有关，在氧化应激、炎症反应、细胞凋亡等基础之上，大量的细胞因子等活性物质被释放，刺激肌成纤维细胞的增殖和分化，促使肺成纤维细胞灶形成和胶原蛋白沉积，然后大量合成ECM，最终形成IPF[11]。其中氧化与抗氧化关系的失衡通常被认为是导致细胞结构氧化损伤进而导致肺纤维化的重要因素之一[12]，活性氧的增加可引起氧化损伤,还能激活纤维化的相关信号通路，最终导致肺结构细胞异常增生、新生血管形成、细胞外胶原沉积等纤维化样改变，机体内的各种抗氧化大分子、小分子和酶的活性，可反映机体清除活性氧基团及分子的能力，能客观反映抗氧化能力的强弱。

SOD和HO-1分别反映了机体清除氧自由基和对组织氧化损伤的保护能力[9，13]，可通过抗氧化应激的机制减轻肺组织纤维化，这种保护作用可能与通过抑制活性氧基团及分子的产生、抑制促纤维化因子纤溶酶原激活物的表达有关，在延缓肺损伤、肺纤维化、肺肿瘤等肺部疾病的发病过程中有着重要的作用。HYP则直接反映肺纤维化的程度，肺间质纤维化的特征表现为成纤维细胞异常增殖和细胞外基质在肺组织内的过多沉积，肺纤维化初期各种生物活性因子诱导纤维母细胞合成、分泌大量胶原蛋白成分，使肺间质胶原明显增加，构成了肺纤维化的病理学基础，作为胶原特有成分的HYP可动态反应肺纤维化的病变进展情况。8-iso-PGF是前列腺素的异构体，是自由基对脂质(如脂膜的不饱和脂肪酸)造成自由基损伤后的特定产物，有研究证明8-异前列腺素可通过凝血酶/前列腺TP受体诱导大鼠气道高反应性，是评价氧化应激程度的生物学指标[14-15]。

本研究的病理切片结果表明，与模型组相比，五味子乙素可以减轻小鼠肺泡炎症程度和肺纤维化程度，表明其具有一定的抗纤维化作用。实验结果显示五味子乙素能明显升高肺组织中SOD和HO-1水平、降低HYP和8-iso-PGF水平，表明其可能通过减轻氧化反应和提高抗氧化水平的作用来发挥抗肺纤维化的作用。

周平安教授根据几十年的临床经验总结，认为五味子在治疗肺纤维化等方面有较好的疗效，在此基础上查阅文献得知，其主要成分五味子乙素具有抗炎、抗氧化等多种药理作用，此前关于五味子乙素的研究多是集中在肝纤维化、肾纤维化等方面，尚未从抗氧化的角度研究对肺纤维化的干预作用，因此，本课题组选用五味子乙素作为研究对象，探讨其对肺纤维化的干预作用。

综上所述，五味子乙素可能通过提高组织抗氧化水平、减轻氧化应激反应，从而抑制胶原纤维的合成，达到抑制和延缓肺纤维化进展的目的，减轻肺纤维化的程度，深入研究其作用机制可为五味子的临床应用奠定理论和实验基础。