复发性流产患者绒毛及蜕膜组织中BUB3和BubR1的表达研究

赵 娟 李 辉 陈广新 杜利军 张晓丽 曹天生

1.广州市花都区人民医院检验科，广东广州 501800；2.广州市花都区人民医院内科，广东广州 501800；3.广州市花都区人民医院妇产科，广东广州 501800；4.广州市花都区人民医院外科，广东广州 501800

复发性流产（recurrent miscarriage，RM）指妊娠28周前发生3次及3次以上的自然流产，其发病率为1%～3%[1-2]。但多数学者认为连续发生2次流产就应给予重视并进行评估，因为其风险与流产3次者接近[3]。RM 病因复杂，各因素之间相互影响，染色体异常、内分泌失调、自身免疫因素等均可导致发病[4]。因此针对RM的诊断只能依靠各种辅助检查筛查病因。研究发现，流产胚胎细胞处于分裂中期时，纺锤体检查点（spindle checkpoint，SAC）需要确保全部染色体均能连接到纺锤体微管上，进而排列在细胞赤道板上，使细胞能够进入分裂后期[5]。BUB3（budding uninhibited by benzimida-zole 3，BUB3）是一种磷酸氨基酸衔接子，是SAC 结构相关的复合物成分之一，这些复合物具有功能不同的旁系同源物，如Bub1 相关蛋白（Bub1 related protein，BubR1）。而BubR1的水平与SAC的功能存在一定的剂量依赖，该基因一旦缺失将引起大量非整倍体产生，从而引发SAC的功能失调，细胞分裂抑制，导致胚胎发育迟缓[6-8]。本研究探讨BUB3 及BubR1 在RM患者绒毛及蜕膜组织中的表达及其与RM的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年3月～2018年3月于广州市花都区人民医院就诊的50例稽留流产孕妇作为病例组，另选取同期50例正常人工流产妇女作为对照组。纳入标准：①符合《复发性流产诊治的专家共识》中RM 定义[1]；②自行经阴道排出妊娠组织或经临床确诊为稽留流产的患者；③RM次数（包括此次入院前妊娠后流产）≥3次。排除标准：①存在生殖道畸形者；②生殖道感染者；③患有严重肝肾等系统性疾病者。收集受试者的年龄、体重指数（body mass index，BMI）、孕次、产次、总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）等一般资料。所有研究对象或其直系亲属签署知情同意书，本研究所用方法符合《赫尔辛基宣言》，且经广州市花都区人民医院伦理委员会审核批准。

1.2 主要试剂与仪器

-80℃超低温冰箱（美国Thermo 公司），一抗为兔抗人BUB3、BubR1（Abcam 公司），二抗为羊抗兔IgG（Abcam 公司），BCA 试剂盒（北京中杉金桥公司），荧光实时定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）仪（美国Applied biosygtems 公司），Trizol 试剂（美国Invirotrogen 公司），逆转录试剂盒（北京天根生物科技公司），SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（大连TaKaRa 公司），引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成。TC、TG、LDL-C、HDL-C 试剂盒（批号KH216、KJ919、ER363、KF707） 均由富士胶片和光纯药株式会社提供。

1.3 方法

1.3.1 样本采集及处理 无菌条件下对稽留流产患者进行清宫术，术后挑取胚胎绒毛组织（villous tissue，VT）、蜕膜组织（decidual tissue，DT）分成两份，一份提取总RNA，一份进行组织蛋白的提取。

1.3.2 实时荧光定量PCR 检测受试者胚胎VT、DT 中BUB3 mNRA、BubR1 mNRA 水平 采用Trizol 法提取受试者胚胎VT、DT 样本中的总RNA，用分光光度计测总RNA 纯度，根据逆转录试剂盒说明书将RNA 反转录为cDNA。参照SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒说明书进行qRT-PCR 反应，以GAPDH 基因为内参，BUB3 mNRA、BubR1 mNRA、GAPDH 引物序列见表1。反应条件为：95℃，10 min；40个PCR 循环（95℃，10 s；60℃，60 s；72℃，15 s）。采用2-ΔΔCt 方法计算样本中BUB3 mNRA、BubR1 mNRA 相对表达量。

1.3.4 蛋白免疫印迹（Western Blot）检测受试者组织中BUB3、BubR1 蛋白表达 将胚胎VT、DT 组织剪碎，加入蛋白裂解液，冰浴30 min，4℃，10 000 r/min，离心30 min，吸取上清液至EP 管。用BCA 法测定全细胞裂解液蛋白浓度，每孔取50 μg 进行SDSPAGE电泳，一抗（BUB3、BubR1抗体，稀释倍数1:500）孵育4℃过夜，羊抗兔二抗（1:10 000）室温孵育2 h，增强化学发光显色，采用Quantlty One 软件进行灰度值分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用率表示，两组间比较采用χ2检验；采用Logistic回归分析RM 发生的影响因素，以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 qRT-PCR 引物序列

2 结果

2.1 两组一般资料的比较

病例组的年龄、BMI、产次、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），病例组的孕次多于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 两组一般资料的比较（）

表2 两组一般资料的比较（）

组别 例数年龄（岁）BMI（kg/m2）孕次（次）产次（次）TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）对照组病例组χ2/t值P值50 50 34.56±3.25 35.13±3.86 0.799 0.426 26.68±5.73 26.75±5.36 0.063 0.950 1.58±0.32 3.85±0.83 18.044 0.000 0.85±0.21 0.92±0.25 1.516 0.133 4.35±0.85 4.62±0.93 1.515 0.133 1.89±0.23 1.94±0.26 1.019 0.311 2.61±0.62 2.75±0.63 1.120 0.265 1.03±0.23 1.06±0.31 0.550 0.584

2.2 两组BUB3mRNA、BubR1 mRNA表达的比较

病例组VT、DT 中BUB3 mRNA、BubR1 mRNA 水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组和病例组VT 中BUB3 和BubR1 mRNA 水平均高于DT，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

表3 两组BUB3 mRNA、BubR1 mRNA表达的比较（）

表3 两组BUB3 mRNA、BubR1 mRNA表达的比较（）

与VT 比较，*P＜0.05

组别 例数 BUB3 mRNA/GAPDH VT DT BubR1 mRNA/GAPDH VT DT对照组病例组t值P值50 50 1.02±0.19 0.73±0.08 9.947 0.000 0.83±0.11*0.51±0.05*18.727 0.000 1.23±0.21 0.76±0.13 13.456 0.000 1.02±0.15*0.53±0.06*21.447 0.000

2.3 两组BUB3 及BubR1 蛋白表达的比较

病例组VT、DT 中BUB3、BubR1 蛋白表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组和病例组VT 中BUB3 和BubR1 蛋白表达水平均高于DT，差异有统计学意义（P＜0.05）（表4，图1）。

表4 两组BUB3 及BubR1 蛋白表达的比较（）

表4 两组BUB3 及BubR1 蛋白表达的比较（）

与VT 比较，*P＜0.05

组别 例数 BUB3 VT DT BUBR1 VT DT对照组病例组t值P值50 50 1.34±0.25 0.75±0.11 15.275 0.000 0.93±0.16*0.56±0.05*15.608 0.000 1.03±0.19 0.54±0.07 17.112 0.000 0.76±0.12*0.35±0.03*23.438 0.000

图1 两组BUB3 及BubR1 蛋白表达情况

2.4 Logistic回归分析RM 发生的影响因素

以行流产手术孕妇是否发生RM 为因变量，以流产孕妇孕次、BUB3 mRNA、BubR1 mRNA 水平为自变量进行Logistic回归分析，孕次、BUB3 mRNA、BubR1 mRNA 为发生RM的危险因素（P＜0.05）（表5）。

表5 Logitic回归分析RM 发生的影响因素

3 讨论

RM是一种较为罕见的疾病，病因复杂，是目前基础与临床研究的难点和热点[9-10]。研究发现，细胞分裂过程中，SAC 能够监控细胞分裂中期全部染色体与纺锤体微管的连接情况，若SAC 相关基因表达异常，则会导致细胞分裂受到抑制或细胞染色体数目出现异常[5，11]。SAC 在细胞分裂中后期能够抑制细胞分裂周期基因20（cell division cycle gene 20，Cdc20）激活后期促进复合物/环体（anaphase-promoting complex/cyclosome，APC/C），使细胞保持于分裂中期，保证染色体与纺锤体正常连接，二者正确结合后，SAC 失活，APC/C-Cdc20 泛素化分离酶抑制剂及细胞周期蛋白B，使染色体正确分离，细胞分裂进入后期[12-13]。因此探讨胚胎细胞分裂过程中SAC 基因的表达，对探明流产发生的机制具有重要意义。

Wei 等[14]将BUB3、BubR1基因过表达以及采用RNA 干扰方法，分析SAC 复合物在小鼠胚胎中的作用。结果表明，过表达的SAC 成分通过阻止姐妹染色单体分离而抑制了细胞中期-后期的转变。RNA 干扰方法删除SAC 成分会加速第一次减数分裂过程中的中期-后期过度，并导致微核形成，染色体错位或非整倍性，造成胚胎发育迟缓，说明SAC 及其表达基因对卵裂期小鼠胚胎中有丝分裂细胞周期进程的调节至关重要。本研究结果显示，病例组VT、DT 中BUB3及BubR1 mRNA 和蛋白水平均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组和病例组VT 中BUB3 及BubR1 mRNA 和蛋白水平均高于DT，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示病例组BUB3 及BubR1 水平降低，造成SAC 复合物含量异常，胚胎细胞分裂过程中形成非整倍体细胞，且主要集中于滋养细胞胞浆内，可能具有VT 细胞特异性，最后产生致死性胚胎，从而导致流产。

有研究报道，缺失BUB3、BubR1或MAD2的小鼠有早产现象，因成纤维细胞内缺乏SAC，细胞表现为非整倍性[15]。Logistic回归分析结果显示，孕次、BUB3及BubR1 mRNA 均是发生RM的危险因素，提示孕次及BUB3 及BubR1 mRNA 与RM 发生有关。

综上所述，RM患者VT、DT中BUB3 及BubR1 mRNA 和蛋白水平均降低，且VT 中BUB3 及BubR1 mRNA 和蛋白水平均高于DT，BUB3 及BubR1 mRNA是RM的危险因素，可能对RM 有潜在预测价值。本研究存在研究方法单一，研究深度及影响因素不够丰富的不足，RM患者中BUB3 及BubR1的作用机制仍需进一步验证。