拮抗马铃薯干腐病病原菌活性菌株的筛选及鉴定

贾鹏莉，沈 硕

(青海大学农林科学院，青海省马铃薯育种重点实验室，青藏高原生物技术教育部重点实验室，青海 西宁 810016)

马铃薯是全球第四大重要粮食作物，但在贮藏过程中，容易被马铃薯晚疫病、马铃薯黑痣病、马铃薯枯萎病、马铃薯干腐病、马铃薯早疫病、马铃薯癌肿病、马铃薯银腐病、马铃薯黄萎病、马铃薯粉痂病等多种病害侵袭[1]。其中，马铃薯干腐病是马铃薯贮藏期主要的真菌性病害之一，其由多种镰刀菌(Fusariumspp.)引起[2]。据统计，每年由马铃薯干腐病造成的产量损失为6%～25%，最高可达60%[3-5]。生产中对这种病害的防治以化学防治手段为主，常用的药剂有苯醚甲环唑·嘧菌酯、霜脲·锰锌、戊唑醇等，但长期使用化学药剂防治，容易造成菌株抗药性、环境污染和农药残留等严重问题[6-7]。生物防治是利用有益生物及其代谢产物来控制植物病虫害的方法，具有不易产生抗药性、不污染环境和安全无毒等优点[8-9]。因此，利用微生物等天然资源及其代谢产物对马铃薯干腐病进行生物防治具有重要意义。目前，已报道可用于防治马铃薯干腐病的生防菌有芽孢杆菌(Bacillusspp.)[10]、放线菌(Actinomycesspp.)[11]、木霉菌(Trichodermaspp.)[12]、伯克霍尔德菌(Burkholderiaspp.)[13]、假单胞菌(Pseudomonasspp.)[14]等。白酒糟醅是以谷物为原材料经发酵、蒸馏、提取酒精等加工后所残余的废渣物料。近年来，白酒糟醅多应用于食品[15]、饲料[16]、以及抗癌[17]等方面的研究。已有研究显示青稞白酒糟醅在抑草、抑菌和抗病毒等方面具有生物活性[18]。有关生物防治细菌抑制植物病原真菌的报道较多，但用其抑制马铃薯干腐病病原菌的报道较少。前期发现一株分离自青稞白酒糟醅的菌株JZ2-1-12对马铃薯干腐病病原菌具有抑菌活性[19]。本研究对18株分离自青稞白酒糟醅的菌株进行抑菌活性筛选，采用生理生化特征及分子生物学方法对活性菌株进行鉴定，并测定活性菌株发酵液萃取物的抑菌活性和稳定性，以期为微生物来源的马铃薯干腐病生物防治菌剂及保鲜制剂的开发提供新的理论基础和技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株

18株待测菌株均分离自青稞白酒糟醅。马铃薯干腐病病原真菌青9A-2-6、青9A-5-7、青9A-5-10、青9A-4-13分离自马铃薯青薯9号薯块病样，为镰刀菌(Fusariumspp.)，均纯化保存至青海大学农林科学院生物技术研究所微生物实验室4 ℃冰箱。

1.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖培养基(马铃薯200 g,葡萄糖15 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL)，牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2)。

1.1.3 主要仪器

电子天平(梅特勒—托利多仪器有限公司)；高压蒸汽灭菌锅(华粤企业集团有限公司)；电热恒温干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)；生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；全温摇瓶柜(常州金坛精达仪器制造有限公司)。

1.2 菌株活化

将保存的分离自青稞白酒糟醅的菌株从4 ℃冰箱取出，接种于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，倒置于37 ℃恒温培养箱中培养48 h，备用。

1.3 活性菌株的筛选及稳定性评价

采用平板对峙法[20]，在距直径9 cm的培养皿边缘2 cm处接种分离自青稞白酒糟醅的菌株，相对的另一侧接种直径5 mm的病原真菌，每个处理重复3次，以只接种病原真菌的处理作为对照。置于28 ℃生化培养箱中培养7 d，观察分离自青稞白酒糟醅的菌株与病原真菌之间有无抑菌带出现，测量菌落直径，计算抑菌率。计算公式如下：

抑制率(%)=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100

为了确定活性菌株的稳定性，将筛选得到的有抑菌活性的菌株进行稳定性评价，方法同上。分别将供试拮抗菌和病原真菌对峙培养7 d和14 d后，测量抑菌带宽度，计算14 d时抑菌带宽度缩小率(VF)，比较各活性菌株的抑菌稳定性。稳定评价标准[21]：“--”,VF≥70%为不稳定；“-”,50%≤VF<70%为较不稳定；“+”,20%≤VF<50%为较稳定；“++”,VF<20%为稳定。计算公式如下：

VF(%)=[(7 d抑菌带宽度值-14 d抑菌带宽度值)/7 d抑菌宽带值]×100

1.4 活性菌株的鉴定

1.4.1 活性菌株的生理生化特征

根据《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)[22]和《常见细菌系统鉴定手册》[23]对活性菌株分别进行葡萄糖氧化发酵，柠檬酸盐利用，接触酶，糖、醇类发酵，石蕊牛奶测试，明胶液化，甲基红(M.R)，硝酸盐还原，V-P测定以及O-硝基苯-β-D吡喃半乳糖苷酶(ONPG)测定等试验。

1.4.2 活性菌株的分子生物学鉴定

活性菌株DNA提取根据上海生工生物工程股份有限公司的柱式细菌DNA提取试剂盒的程序操作。选择通用的细菌16S rDNA引物F27(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA GG-3′)和P1541(5′-AAGGAGGTGGTGATCCAGCCG CA-3′)。PCR 扩增体系10×Buffer 2.5 μL，dNTP(10 mmol /L)2 μL，模板DNA 1 μL，引物各1 μL，Taq DNA聚合酶 0.2 μL，水补足至25 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 40 s，退火55 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 80 s，35个循环；72 ℃ 10 min。反应结束后，取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收产物送至上海生工生物工程股份有限公司测序。将得到的16S rDNA序列在网站https：//www.ezbio cloud.net/上进行序列对比，用MEGA 7.0软件，采用Neighbor-Joining方法(Bootstrap值为1 000次)，绘制系统发育进化树[24]。

1.5 统计分析

数据采用IBM SPSS Statistics 24.0进行分析，数据均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 抑制马铃薯干腐病病原真菌活性菌株的筛选

2.1.1 分离自青稞白酒糟醅的菌株对病原菌青9A-2-6的抑菌活性

对18株分离自青稞白酒糟醅的菌株抑制青9A-2-6的活性进行了测定，由表1可知，菌株JZ1-4-10对病原菌青9A-2-6有较强抑菌活性，抑制率为74.12%。菌株JZ1-1-9病原菌青9A-2-6有中等强度抑菌活性，抑制率为69.22%。其他菌株对病原菌青9A-2-6没有抑菌活性，且与菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9抑菌作用差异显著(P<0.05)。

表1 分离自青稞白酒糟醅的菌株抑制病原菌青9A-2-6的活性

2.1.2 分离自青稞白酒糟醅的菌株对病原菌青9A-5-10的抑菌活性

对18株分离自青稞白酒糟醅的菌株抑制青9A-5-10的活性进行了测定，由表2可知，菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9对病原菌青9A-5-10有抑菌活性，抑制率分别为47.16%、41.97%。其他菌株对病原菌青9A-5-10没有抑菌活性，且与菌株JZ1-4-10、 JZ1-1-9抑菌活性差异显著(P<0.05)。

2.1.3 分离自青稞白酒糟醅的菌株对病原菌青9A-5-7的抑菌活性

对18株分离自青稞白酒糟醅的菌株抑制青9A-5-7的活性进行了测定，由表3可知，菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9对病原菌青9A-5-7有中等抑菌活性，抑制率分别为68.25%、60.44%。其他菌株对病原菌青9A-5-7没有抑菌活性，且与菌株JZ1-4-10、JZ1-1-9抑菌活性差异显著(P<0.05)。

表3 分离自青稞白酒糟醅的菌株抑制病原菌青9A-5-7的活性

2.1.4 分离自青稞白酒糟醅的菌株对病原菌青9A-4-13的抑菌活性

对18株分离自青稞白酒糟醅的菌株抑制青9A-4-13的活性进行了测定，由表4可知，菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9对病原菌青9A-4-13有中等抑菌活性，抑制率分别为62.95%、59.67%。其他菌株对病原菌青9A-4-13没有抑菌活性，且与菌株JZ1-4-10、JZ1-1-9抑菌活性差异显著(P<0.05)。

表4 分离自青稞白酒糟醅的菌株抑制病原菌青9A-4-13的活性

表5 分离自青稞白酒糟醅的菌株对病原菌抑菌活性的稳定性

2.2 活性菌株的稳定性评价

通过初筛，共筛选出2株对马铃薯病原真菌有抑菌作用的活性菌株，分别为菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9。为了确定它们抑菌活性的稳定性，进行抑菌活性的稳定性评价。如表5所示，菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9对马铃薯病原真菌青9A-2-6、青9A-5-7和青9A-5-10的抑菌活性稳定性较强，稳定性为“++”；对青9A-4-13的抑菌活性稳定性较弱，稳定性为“+”；青9A-2-6、青9A-5-7和青9A-5-10与青9A-4-13稳定性差异显著(P<0.05)。可见，菌株JZ3-1-15和JZ1-1-9对病原菌青9A-2-6、青9A-5-7和青9A-5-10的抑菌活性稳定。

2.3 活性菌株的鉴定

2.3.1 生理生化鉴定

由表3可知，菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9均可使明胶液化，石蕊牛乳凝固，可利用蔗糖、麦芽糖及柠檬酸，有氧或无氧分子均参与分解葡萄糖，可以产生ONPG，而接触酶试验和V-P试验均呈阴性。菌株JZ1-4-10不能利用甘露醇，甲基红实验呈阴性，硝酸盐还原呈阳性。菌株JZ1-1-9还可利用甘露醇，甲基红实验呈阳性，硝酸盐还原呈阴性。

表6 菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9的生理生化特征

2.3.2 分子生物学鉴定

将菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9测序得到的16S rDNA序列提交至https：//www.ezbiocloud.net/，与数据库中已知的16S rDNA序列进行比对，并下载与菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9的16S rDNA序列同源性大于95%的序列，使用MEGA 7.0软件，根据Neighbor-Joining方法构建系统发育树(图1)。结果表明，菌株JZ1-4-10与暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)聚类同一分支，亲缘关系最近，相似度高达99.58%；菌株JZ1-1-9与菌株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)聚类同一分支，亲缘关系最近，相似度高达100%。结合菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9的生理生化特征和16S rDNA序列分析结果，最终将菌株JZ1-4-10鉴定为暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)，菌株JZ1-1-9鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)。

3 讨论与结论

目前，马铃薯干腐病贮藏病害的防治以化学药剂为主，但是长期施用化学药剂已造成一系列严重问题，生物防治手段对环境无污染，安全性高，成为解决这一问题的有效途径。本研究结果发现，分离自青稞白酒糟醅的18株菌中有2株对马铃薯干腐病病原菌有较好的抑菌活性，说明来源自青稞白酒糟醅中的2株芽孢杆菌具有被开发为生物防治药剂的潜力。

经鉴定，菌株JZ1-1-9为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，菌株JZ1-4-10为暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)，均属于芽孢杆菌属。张德峰等[25]研究发现，芽孢杆菌对马铃薯干腐病具有较好的防治效果。据报道，贝莱斯芽孢杆菌对烟草黑胫病菌、水稻条斑病菌、西瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、草莓炭疽病菌、小麦赤霉病菌等植物病原菌有显著的抑菌活性[26-29]。近十年来新发现的暹罗芽孢杆菌，具有广谱的抑菌活性，其对火龙果炭疽病菌、棉花立枯病菌、花生白绢病菌、梨黑斑病菌等均有显著的抑菌作用[30-31]。关于分离自青稞白酒糟醅贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)和暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)对马铃薯干腐病的防治未见报道，本研究为马铃薯干腐病的生物防治提供一种新来源。

贮藏马铃薯容易腐烂，这种情况在农户窖藏中非常普遍，是制约马铃薯贮藏质量和影响窖藏收益的主要瓶颈。本研究从生物防治研究出发，对来源青稞白酒糟醅的18株菌通过平板对峙法筛选出有抑制马铃薯干腐病病原菌的活性菌株，证明分离自青稞白酒糟醅的菌株确实对马铃薯干腐病的防治有一定的作用。该研究结果有望将青稞白酒酒糟开发成一种新型、高效、低毒的微生物能源，可以为植物病害的生物防治奠定坚实的理论基础。下一步将进行抑菌作用机理、靶标位点、生防抑菌剂、以及代谢产物等方面的研究。