高粱GRF基因家族鉴定及在非生物胁迫下的表达分析

崔江慧, 杨溥原, 常金华

(河北农业大学农学院， 河北 保定 071001)

高粱是禾本科C4植物，光合能力强，适应范围广，是我国不可或缺的粮食作物[1]。随着全球人口不断增长和环境恶化越发迅猛，高粱因其抗旱、耐寒、耐盐碱能力出众，近年来受到育种学家的广泛关注[2-4]。2009年，高粱全基因组测序工作完成，为探索高粱基因家族功能提供了重要基础[5]。

生长调控因子(growth regulation factor，GRF)是植物中特有的一类转录因子[6]，其N端有QLQ和WRC两个保守结构域[7]，在植物生长发育中发挥重要作用，广泛参与逆境胁迫的响应[8]。van der Knaap等[9]于2000年在水稻中鉴定出第一个GRF因子基因，将其命名为OsGRF1，并发现该基因可以通过诱导赤霉素调节水稻茎的伸长，随后在水稻中共鉴定出12个GRF家族成员。近年来，随着越来越多物种基因组测序完成，更多的GRF家族成员被鉴定出来[10]。拟南芥鉴定出9个GRF家族成员[11]，并发现拟南芥GRF突变体与植物矮化、叶片变小有关；此外，茶树(11个)、大麦(12个)、毛竹(18个)、桃(10个)、油菜(19个)、玉米(14个)、藜麦(18个)等作物中均相继鉴定出GRF基因并开展了相应研究，并且发现GRF基因广泛参与多种激素调节的胁迫应答、种子发育、花发育等多个领域[12-18]，但还未见高粱GRF家族基因的相关报道。为探究高粱GRF家族基因的结构及其在高粱应对非生物胁迫中的作用，本研究对高粱GRF家族基因进行鉴定及生物信息学分析，基于RNA-seq数据，分析高粱GRF家族基因在不同胁迫条件下的表达差异，为研究逆境胁迫下高粱GRF家族基因的作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 GRF家族数据下载

高粱、拟南芥、水稻、谷子和玉米全基因组数据来源于Ensembl Plants数据库(http://plants.ensembl.org/index.html)，GRF蛋白两个特征保守结构域QLQ.hmm(PF08880)和WRC.hmm(PF08879)的隐马可夫模型在Pfam数据库(http://pfam.xfam.org/)获得。

1.2 GRF家族基因筛选鉴定

在Linux系统下，利用HMM3.0软件分别根据两个特征保守结构域筛选GRF基因，通过SMART(http://smart.embl.de/)、NCBI CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)和pfam(http://pfam.xfam.org/)验证，最终确定GRF家族基因。

1.3 GRF家族基因染色体定位和理化性质

利用Linux命令获取所得高粱GRF家族基因的位置信息，利用MapChart2.32软件绘制基因染色体定位图。利用ExPASy-ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)获取GRF基因的分子量、氨基酸数目、等电点和亲水性等信息[19]。

综上所述，现有关于产城融合发展水平的研究主要集中在我国整体和东部区域，鲜有学者关注欠发达地区产城融合发展水平情况，因而难以具体分析我国各区域产城融合发展的深层次问题。对于产城融合发展的影响因素研究主要侧重于探讨某一类产业与城市融合发展，并且已有研究鲜有在产、城、人三者融合互促的基础上去探讨产城融合发展水平及其影响因素。因此，本文以产、城、人三者融合为基本思路框架，对新疆产城融合发展水平进行测度，同时对产城融合发展影响因素的作用机理进行探讨，并对其进行量化分析，最后提出促进新疆产城融合发展的对策建议。

1.4 GRF家族基因序列和结构分析

利用MEGA7.0软件分析基因进化关系，利用ClustalW对蛋白序列进行多序列比对，利用邻接法(NJ)，参数设置默认值，构建系统发育树。

利用Linux系统下的MEME软件对高粱GRF家族基因进行保守结构域分析，设定基序长度5～100，motif数目为5个，利用在线软件GSDS2.0获取基因结构信息。通过TBtools绘制高粱GRF家族系统发育树、保守结构域、基因结构。通过Linux系统McscanX软件对高粱家族基因信息进行分析，分别利用Circos和McscanX软件分析高粱种内共线性和高粱与拟南芥、玉米、谷子种间共线性。整合高粱GRF家族基因启动子序列，通过Plant CARE数据库(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)将顺式作用元件可视化。

1.5 高粱GRF家族基因表达特征分析

为进一步分析GRF基因家族在高粱胁迫应答中的作用，本研究基于盐胁迫和烯效唑处理下的转录组数据绘制表达热图(图8)。从不同耐盐性品种GRF基因响应情况可以看出，多数基因在盐胁迫下表达均较为活跃，仅SORBI_3004G269900和SORBI_3010G077200表达量较低，推测这两个基因可能受到盐胁迫的抑制；SORBI_3002G297800在耐盐性强的高粱蔗中呈升高趋势，在盐敏感品种河农16中表达量呈现先下降后上升的的趋势；烯效唑处理下多数基因在各处理下表达量变化不明显，SORBI_3006G203400在处理7～14 d的表达量较对照显著增高，处理14 d后的表达量较对照有极其显著的增高，该基因含有抗氧化逆境响应元件(ARE)和光应答元件，说明SORBI_3006G203400在植物应对胁迫响应，减轻胁迫危害，促进恢复生长过程中可能起到重要作用。

为了解高粱GRF基因家族系统发育的关系，本研究筛选了玉米、水稻、谷子和拟南芥的基因序列，分析了物种内和物种间的亲缘关系，结果如图2所示。根据系统发育树内各GRF基因亲缘关系的远近，将高粱(8个)、玉米(14个)、水稻(11个)、谷子(10个)和拟南芥(9个)的GRF基因划分为7个亚族(Group1～Group7)。其中Group1、 Group6和Group7所含同源性基因最多，均为11个；Group2和Group3中GRF基因最少，仅2个，且都是拟南芥GRF基因，表明拟南芥和其他4类禾本科作物亲缘关系较远。除Group2和Group3外，其余5个亚族中高粱、玉米、水稻、谷子的GRF基因个数平均分布。从亲缘关系看，GRF基因家族中高粱和谷子、玉米亲缘关系最近，其次是水稻。在所比较的禾本科作物中，玉米该家族基因数量最多。

他们一起喝过很多酒。加班深夜，烧烤摊撸着串畅谈人生喝的是珠江纯生。情场失意，在酒吧相对无言看灯红酒绿喝的是威士忌。职场得意，在西餐厅欢声笑语水晶杯里盛的是葡萄酒。远行归来，在小酒馆感慨万千一人一壶执的是温热黄酒。麋鹿小姐才知道，原来酒有这么多种味道。人生百态尽在其中，诉尽一切悲欢离愁。

2 结果与分析

2.1 高粱GRF家族基因染色体定位及理化性质分析

用特征保守结构域QLQ和WRC的隐马克夫模型对高粱全基因组数据进行分析，最终筛选出8个GRF家族基因(表1)。对8个GRF基因理化性质进行分析，结果显示，高粱GRF家族基因编码数目差异不大，其中SORBI_3002G297800 含271个氨基酸，在高粱GRF家族成员中最少，SORBI_3001G104500所含氨基酸数量最多，达到601个；蛋白质分子量(molecular weight,MW)范围在28 314.2(SORBI_3002G297800)～62 484(SORBI_3001G104500)kD之间；等电点范围在4.73(SORBI_3002G297800)～9.73(SORBI_3010G077200)之间，平均等电点为7.95；高粱GRF基因家族所有成员的亲水系数(grand average of hydrophy, GRAVY)均为负值，范围在-0.292(SORBI_3001G104500)～-0.745(SORBI_3004G317000)之间，表明这些成员均为亲水蛋白(表1)。染色体定位显示，8个高粱GRF基因家族成员不均匀分布在6条染色体上，其中1号和4号染色体均含有2个GRF基因，2、5、6、10号染色体各含1个GRF基因，其他染色体上无GRF基因，所有GRF基因均分布在染色体两端(图1)。

对8个高粱GRF家族基因上游启动子1 500 bp序列所含顺式作用元件进行分析，结果如图7所示，有7个GRF基因存在脱落酸响应元件(ABRE)、2个GRF基因存在干旱诱导响应元件(MBS)、6个GRF基因存在茉莉酸响应相关元件(CGTCA-motif、TGACG-motif)，6个GRF基因分别存在抗氧化逆境响应元件(ARE)和生物及非生物胁迫响应元件(as-1)；5个GRF基因存在种子特异性调节顺式元件(RY-element)；4个GRF基因存在低温响应元件(LTR)；2个GRF基因存在伤害应答元件(WUN-motif)。

表1 高粱GRF基因家族成员信息Table 1 Information of GRF gene family members of sorghum

注:染色体左侧标记为位置，右侧为基因ID。Note: Mark on the left of chromosome shows localization, and that on the right shows gene ID.图1 高粱 GRF家族成员染色体定位Fig.1 Chromosome localization of sorghum GRF family members

2.2 高粱GRF家族系统进化分析

心内科作为临床急重症科室，有别于普通内科病房，涉及介入手术、操作及多种药物，专科护士培养内容多且掌握困难[6]。在传统的心内科专科护士培养模式中，多以带教老师依据自身经验传授及培训学员参加业务学习为主要途径，学员往往需要通过长时间自我摸索才能达到培训要求。文献报道及我院培训经验均表明，专科护士培训中普遍存在带教教师能力及经验不足，护理师资队伍培训不完善[7]以及培训过程中缺乏有效监督管理等问题[8]。

2.3 高粱GRF家族保守蛋白序列的基因结构

利用生物信息学技术对高粱GRF家族蛋白质保守序列进行分析，得到5个motif(图3)。可以看出，高粱GRF基因所含内含子和外显子的数量和长度均存在较大差异，除SORBI_3010G077200仅含有一个内含子外，其余7个GRF基因含有2个及以上内含子；所有GRF基因均含有2～5个外显子，其中SORBI_3004G269900和SORBI_3006G203400所含外显子最多，均为5个。

注：SORBI—高粱；Os—水稻；Zm—玉米；SETIT—谷子；AT—拟南芥。Note: SORBI—Sorghum bicolor; Os—Oryza sativa; Zm—Zea mays; SETIT—Setaria italica; AT—Arabidopsis thaliana.图2 高粱、玉米、水稻、谷子及拟南芥GRF家族基因系统发育树Fig.2 Phylogenetic trees of GRF family genes among Sorghum bicolor, Oryza sativa, Setaria italica, Zea mays and Arabidopsis thaliana

图3 高粱GRF家族保守蛋白序列及基因结构Fig.3 Conserved protein sequence and gene structure of sorghum GRF family

为研究高粱GRF家族基因在物种间的进化关系，绘制了高粱与拟南芥、玉米、谷子GRF家族的物种间共线性图，如图6所示。可以看出，5个高粱GRF基因和6个玉米GRF基因显示出6对共线性关系；8个高粱GRF基因与8个谷子GRF显示出共线性；高粱与拟南芥只有1对GRF基因显示出共线性。在高粱与玉米、谷子的多对共线性关系中，SORBI_3001G104500、SORBI_3001G139800、SORBI_3002G297800和SORBI_3004G317000四个高粱GRF基因同时与玉米和谷子存在共线性。

2.4 高粱GRF基因家族共线性分析

SORBI_3004G317000和SORBI_3004G269900同时存在脱落酸响应元件(ABRE)、干旱诱导响应元件(MBS)、茉莉酸响应相关元件(CGTCA-motif、TGACG-motif)4个顺式作用元件，推测这两个基因可能参与多种环境胁迫的响应；SORBI_3001G139800和SORBI_3005G150900存在一个赤霉素应答相关元件(P-box)，SORBI_3010G077200同时存在两个赤霉素应答相关元件(GARE-motif、TATC-box)，推测这三个基因可能参与赤霉素的调节；SORBI_3001G104500存在水杨酸应答元件(TCA-element)；SORBI_3002G297800存在防御及胁迫响应元件(TC-rich repeats)，这两个基因可能参与干旱等非生物胁迫。由此看出，GRF基因在植物对生物及非生物胁迫响应中具有重要作用。

图4 高粱GRF家族保守蛋白序列Fig.4 Conserved protein sequence of sorghum GRF family

motif1和motif2是GRF家族最具特征的蛋白保守序列(图4)，8个高粱GRF均含有motif1和motif2，并且都以motif2在前，motif1在后的顺序分布。4个GRF含有motif3；6个GRF含有motif4；仅2个GRF含有motif5。此外，SORBI_3004G269900和SORBI_3006G203400处于系统发育树的同一分支，且具有相同的motif，基因结构也极其相似，由此推测两个GRF基因可能具有相似的功能。

2.5 高粱GRF基因家族顺式作用元件

7) 系统具备唯一操作权功能：保证同一时间断面对某设备只有一个点位防误系统可进行倒闸操作。当D5000系统进行操作时，自动闭锁五防主/子站的操作权限；当主/子站防误主机操作时，自动闭锁D5000系统操作权限。

高粱种内GRF基因的共线性关系如图5所示，高粱GRF家族2对基因发生过复制，分别为SORBI_3004G269900和SORBI_3006G203400、SORBI_3004G317000和SORBI_3010G077200，其中，前1对基因都位于高粱4号染色体上。

注：SORBI—高粱；Os—水稻；Zm—玉米；SETIT—谷子；AT—拟南芥。Note: SORBI—Sorghum bicolor; Os—Oryza sativa; Zm—Zea mays; SETIT—Setaria italica; AT—Arabidopsis thaliana.图5 高粱GRF基因家族共线性分析Fig.5 Collinearity analysis of Sorghum GRF gene family

2.6 高粱GRF基因家族对胁迫的响应

选用高耐盐品种高粱蔗(Gaoliangzhe,GZ)和盐敏感品种河农16(Henong 16，HN)为材料，在三叶期以0.8%的NaCl溶液处理幼苗，处理0、48、72 h后取整株植株，-80 ℃保存。烯效唑处理：以农大红1号为材料，在七叶期喷施浓度为1.1 g·L-1的烯效唑，采用配对设计(对照组分别为CK0、CK3、CK7、CK14，处理组为T0、T3、T7、T14),分别在喷施0、3、7、14 d后，从上向下取高粱植株第三片叶子，-80 ℃保存。将保存的高粱叶片用Trizol法提取RNA[20]，完整的RNA用Illumina HiSeq 2500进行高通量测序(百迈客生物科技有限公司)，分析在不同非生物胁迫下高粱GRF基因表达情况，利用TBtools软件绘制表达热图。

3 讨论

GRF转录因子广泛参与雌蕊发育[21]、热胁迫应答[22]、遮荫胁迫[23]和外源激素响应[24]等植物各个器官的生长发育以及逆境胁迫应答。本研究在高粱中筛选和鉴定出8个GRF基因。系统发育树显示，4种禾本科作物GRF基因亲缘关系很近，同一分支上的同源性基因可能存在相似的结构和功能。高粱的基因组约有730 Mb，大于水稻(466 Mb)和谷子(400 Mb)，但仅有8个GRF基因，可能是高粱在进化过程中丢失了部分GRF基因。根据保守蛋白序列和基因结构分析，8个高粱GRF基因均存在两个motif(motif1、motif2)，除SORBI_3010G077200含有一个内含子外，其余7个GRF基因均含有两个内含子，所有基因都存在2～5个外显子，这与时丕彪等[18]对藜麦GRF基因的鉴定结果一致，并且SORBI_3004G269900和SORBI_3006G203400在同一分支上，motif相同，基因结构相似，推测其具有相近的功能。顺式作用元件分析显示，高粱GRF基因存在多种与激素调节、生长发育、胁迫应答方面的作用元件，说明高粱GRF基因可能参与高粱对这些方面的调控应答。

图6 高粱和拟南芥、玉米、谷子GRF基因家族共线性分析Fig.6 Collinearity analysis of GRF gene families of sorghum and Arabidopsis, maize and millet

注：ABRE—脱落酸响应元件；ARE—抗氧化逆境响应元件；ACE—光响应元件；AT1-motif—部分光响应相关元件；Box4—部分光响应元件；CAAT-box—基本元件；CGTCA-motif—茉莉酸响应元件；GA-motif—部分光响应相关元件；GARE-motif—赤霉素应答响应元件；GT1-motif—部分光响应相关元件；LTR—低温响应元件；MBS—干旱诱导响应元件；P-box—赤霉素应答响应元件；RY-element—种子特异性调节顺式元件；TATA-box—基本元件；TATC-box—赤霉素应答响应元件；TCA-element—水杨酸应答元件；TC-rich—防御及胁迫响应元件；TCT-motif—光应答元件；TGACG-motif—茉莉酸响应元件；WUN-motif—伤害应答元件；as-1—生物及非生物胁迫响应元件。Note: ABRE—Abscisic acid response element; ARE—Antioxidant response element; ACE—adversity light response element; AT1-motif—Light response corresponding component; Box4—Light response response component; CAAT-box—Basic element; CGTCA-motif—Jasmonic acid response corresponding element; GA-motif—Part of the light response corresponding element; GARE-motif—Gibberellin response corresponding component; GT1-motif—Light response corresponding component; LTR—Low temperature response element; MBS—Drought-induced response element; P-box—Gibberellin response element; RY-element—Seed specific regulation cis-element; TATA-box—Basic element; TATC-box—Gibberellin response element; TCA-element—Salicylic acid response element; TC-rich—Defense and stress response element; TCT-motif—Light response element; TGACG-motif—Jasmonic acid response element; WUM-motif—Injury response element; as-1—Biological and abiotic stress response to the corresponding components.图7 高粱GRF基因启动子区顺式作用元件Fig.7 Promoter region cis-acting elements of sorghum GRF gene

图8 高粱GRF家族基因非生物胁迫下的表达分析Fig.8 Expression analysis of sorghum GRF gene family under abiotic stress

本研究分别对盐胁迫和烯效唑处理下的转录数据进行了分析。根据盐胁迫下转录组数据分析可知，8个GRF基因中SORBI_3002G297800在耐盐性强的高粱中随盐处理时间增长表达量呈先增长后降低趋势，在河农16中呈现出先降低后升高的趋势；前人研究表明，拟南芥转录因子GRF7可以通过结合DREB2A蛋白，抑制该基因及其下游部分渗透胁迫响应基因的表达[25]；结合该基因的7种顺式作用元件，除去2个基本元件和2个光响应应答元件外，含有1个抗氧化逆境响应元件(ARE)、1个防御及胁迫响应元件(TC-rich)和1个种子特异性调节顺式元件(RY-element)，说明SORBI_3002G297800可能参与多种逆境胁迫应答，且在盐胁迫过程中可能发挥重要作用[6,8,20]。根据烯效唑处理下转录组数据分析可知，在8个GRF基因中SORBI_3006G203400在烯效唑处理后的第14 d表达量有显著提高，这与van der Knaap等[9]对OsGRF1参与赤霉素调控机制的研究相近，因此推测该基因在高粱中可能同样存在此类功能；根据顺式作用元件分析，SORBI_3006G203400含有5个顺式作用元件，其中包括1个抗氧化逆境响应元件(ARE)，结合转录组数据显示，该基因可能在减轻胁迫危害，促进恢复高粱生长过程中起到重要作用。

本文立足于浙江省的果树产业研究观光采摘节庆的时空特征在于：浙江省的城乡经济相对发达，观光采摘节庆起步早，发展相对成熟；浙江省各市的经济水平和地理环境差异明显，具有相对多元化的区域特征；浙江省的果树产业是浙江省的十大主导产业之一，浙江省的观光采摘主要为果树的观光采摘。

高粱GRF家族共线性分析结果表明：基因家族加倍主要是由于同一条染色体上的基因发生自我复制，产生两个或多个串联在一起且亲缘关系很近的基因，因此基因的自我复制在基因扩张和基因功能分化中起重要作用[26]。GRF家族中发生过2对基因复制，SORBI_3004G269900和SORBI_3006G203400为其中一对，而且SORBI_3004G269900和SORBI_3006G203400所含外显子最多，均含有5个，SORBI_3004G269900和SORBI_3006G203400处于系统发育树的同一分支，具有相同的motif，基因结构也极其相似。此外，SORBI_3004G297800和SORBI_3006G203400在盐、烯效唑处理后的表达量均呈现显著变化，说明这两个基因在非生物胁迫下有应答并发挥作用，针对不同的胁迫表现出不同的应答响应，这两个基因在胁迫应答中的响应机制还有待进一步研究。

在第二篇的学习中，主要是依据火电厂机组各个设备来进行控制系统的分析。分析的内容主要有汽包锅炉给水、直流锅炉控制，过热汽温控制，再热汽温控制，机炉协调控制，辅机控制等，由于一个章节包含多个设备，故在此并不按照严格的章节进行分类，而是选择用机组的类型进行分类。

综上所述，本研究通过高粱GRF基因家族鉴定与生物信息学分析及该家族基因在不同胁迫应答中的响应模式分析，筛选到参与胁迫应答的基因，为深入研究GRF基因家族的功能提供了重要参考。