胃癌患者CyPJ、ERp29及CSN5的表达其与预后生存的关系研究

杨敬端 何明 吴品

胃癌是我国常见肿瘤之一，近年来发病率日益增高。据统计，我国每年新发胃癌患者达40 万人，死亡人数达30 万人，严重威胁患者生命安危［1］。尽管近年来胃癌的诊疗取得了显著进步，但在多数发展中国家胃癌的发病率及致死率仍在不断升高［2］。故及时明确胃癌病情进展采取治疗措施具有重要意义。研究发现内质网蛋白质29（Endoplasmic reticulum protein 29，ERp29）在新生蛋白质空间结构的正确折叠及恢复中起着重要作用，与肿瘤发生密切相关［3］。而COP9 信号转移体（COP9 signalosome complex，CSN）是一种多亚基蛋白复合体，通过调控泛素蛋白酶体的降解过程而参与肿瘤的发生发展，在CSN 亚单位中CSN5是CSN 第5 个亚单位，也是其活化中心，与多种肿瘤的进展密切相关［4］。此外，亲环素J（Cyclophilins J，CyPJ）是一类低分子量多功能蛋白，可参与蛋白质合成、修复、免疫抑制、诱导细胞调亡及调节细胞增殖等作用，是目前临床研究恶性肿瘤的新靶点［5］。因此，本研究将分析胃癌患者CyPJ、ERp29 及CSN5 的表达及临床意义。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院2015年6月至2017年6月收治的115 例胃癌患者作为研究对象。男性患者59 例，女性患者56 例，平均年龄（59.31±6.65）岁。收集肿瘤组织及肿瘤旁的正常胃粘膜组织，分别作为癌组织组。纳入标准：①均经病理检查证实且符合日本胃癌学会第72 届会议胃癌的标准治疗指导方案［6］；②术前未接受化疗、放疗等辅助治疗；③本研究患者临床资料均完整；④无其它恶性疾病；⑤受试者签署知情同意书。排除标准：①合并肝、肾、心脏脏器严重疾病者；②合并严重神经功能、认知功能障碍者；③依从性差者。本研究经医院医学伦理委员会批准通过。

1.2 CyPJ、ERp29 及CSN5 水平检测方法

1.2.1 仪器与试剂

SP 试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）、免疫组织化学二抗试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）、磷酸盐缓冲液（PBS）（北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司）、兔抗人CyPJ 抗体（英国Abcam 公司）、兔抗人ERp29 抗体（美国Abcam公司）、兔抗人CSN5 抗体（美国Santa Cruz 公司）。

1.2.2 检测方法

采集所有研究对象胃癌组织及癌旁组织，使用生理盐水清洗表面后保存在10%甲醛溶液中并置于-80℃恒温箱，分为三份。

CyPJ、ERp29 及CSN5 水平的检测采用免疫组织化学方法进行：链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法（Streptomyces avidin peroxidase conjugation，SP）［7］，石蜡切片标本厚2 μm，烘烤60℃，二甲苯脱蜡，浸泡3 次。3 次离子水中浸泡抗原修复切片，磷酸盐缓冲液（PBST）洗3 次。内源性过氧化物酶阻断剂滴加，室温孵育15 min，冲洗。一抗滴加，室温孵育1 h，冲洗。辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG 聚合物滴加，室温孵育30 min。对照组采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗；滴加山羊抗兔二抗（eBioscience）室温孵育30 min。二氨基联苯胺显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，树胶封片。

1.2.3 结果判断

判断CyPJ、ERp29 及CSN5 蛋白范围的标准［8］：每张切片在镜下分别以低倍镜及高倍镜进行观察，对每张切片上中下及里外中9 个位置进行观察，最后对2 位专家判断结果进行比对（差异较大时，需重新同时共同读片确定）。

采用Volm 双评分法［8］进行判定，在染色均匀的肿瘤区，选取5 个高倍镜视野（×400）：按阳性细胞百分率（A 值）评分［7］：＜25%为1 分，25%～50%为2 分，＞50%为3 分；按染色强度（B 值）评分：不着色为0 分，浅棕黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。综合染色阳性细胞数与染色强度判断结果：阴性（-）：0 分，弱阳性（+）：1～2 分，中度阳性（++）：3～4 分，强阳性（+++）：5～6 分；两种计分的乘积为每例的加权分数，加权分数为0 为阴性，其余均为阳性。

1.2.4 随访

所有患者治疗结束后通过电话、微信、到院复诊等方式进行随访3年，随访截止日期为2020年6月30日。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件分析，计数资料以n（%）表示，行χ2检验；计量资料采用（±s）描述，行t检验；予以Kaplan-Meier 生存分析CyPJ、ERp29 及CSN5 表达对胃癌患者预后生存的影响；采用Logistic 回归分析影响胃癌患者预后生存的危险因素，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组CyPJ、ERp29 及CSN5 的表达情况比较

胃癌组织组CyPJ、CSN5 阳性表达率显著高于癌旁正常组织组，ERp29 阳性表达率显著低于癌旁正常组织组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1。

表1 两组CyPJ、ERp29 及CSN5 的表达情况比较［n（%）］Table 1 Comparison of the expression of CYPJ，ERp29 and CSN5 between 2 groups［n（%）］

图1 胃癌组织CyPJ、ERp29、CSN5 免疫组化染色图（SP，×500）Figure 1 immunohistochemical staining of CYPJ，ERp29 and CSN5 in gastric cancer tissue（SP，×500）

2.2 CyPJ、ERp29 及CSN5 与胃癌患者不同病理参数的关系

年龄、性别、浆膜浸润与胃癌患者CyPJ、ERp29及CSN5 表达无相关（P＞0.05）。临床分期、浸润深度、淋巴结转移与患者CyPJ、CSN5 表达呈正相关，组织分化程度与CyPJ、CSN5 表达呈负相关（P＜0.05）。ERp29 与组织分化程度呈正相关，与临床分期、浸润深度、淋巴结转移呈负相关（P＜0.05）。见表2。

2.3 115 例胃癌患者预后情况

截至随访结束，115 例胃癌患者生存79 例，死亡36 例，死亡率为31.30%。

CyPJ 表达阴性及表达阳性中位生存时间分别为（42.75±1.82）个月、（30.35±1.01）个月；ERp29 表达阴性及表达阳性中位生存时间分别为（30.79±1.08）个月、（39.76±2.15）个月；CSN5 表达阴性及表达阳性中位生存时间分别为（43.01±2.08）个月、（33.04±1.04）个月。生存分析显示CyPJ 及CSN5（表达阴性）、ERp29（表达阳性）者生存期较长，Keplan-meier 生存曲线明显不同（P＜0.05）。见图2。

表2 CyPJ、ERp29、CSN5 与胃癌患者不同病理参数的关系［n（%）］Table 2 Relationship between CYPJ，ERp29 and different pathological parameters in patients with gastric cancer［n（%）］

图2 CyPJ、ERp29、CSN5 蛋白生存曲线图Figure 2 protein survival curve of CYPJ，ERp29 and CSN5

2.4 影响胃癌患者预后生存的单因素和多因素分析

组织中低分化、TNM 分期：Ⅲ+Ⅳ期、淋巴结转移、ERp29 阴性表达、CyPJ 及CSN5 阳性表达为影响胃癌患者预后生存的独立危险因素（P＜0.05）。见表3。

表3 影响胃癌患者预后生存的单因素和多因素分析Table 3 univariate and multivariate analysis of prognostic factors in patients with gastric cancer

3 讨论

近年来我国胃癌发病率逐年上升，尽管目前胃癌的外科手术已取得长足的进步，但术后复发转移及死亡的风险仍较高［9］。本研究显示，115 例胃癌患者死亡率为31.30%，基本与既往研究相似，故寻求有效治疗靶点对降低胃癌患者死亡率有重要意义。

CyPJ 是亲环素家族成员之一，一方面可协助合成蛋白质，保护蛋白质正确合成；另一方面具有核酸酶活性，参与细胞凋亡进程［10］。目前大量研究证实CyPJ 和乳腺癌、肝癌、神经胶质瘤、甲状腺癌等多种肿瘤发生密切相关［11］。ERp29 是新发现的分子量为29 KDa 的内质网蛋白质，其位于内质网腔，定位于12q24.13 基因，协助新合成蛋白质分泌、转运、折叠蛋白恢复正确空间构象。相关研究表示，内质网会因为体内未折叠或错误折叠蛋白质增多而发生未折叠蛋白质反应，这时未折叠蛋白质反应发出的信号调节会限制mRNA 的翻译速度，使其表达水平下降，引发肿瘤［12］。Tang W 等学者［13］对乳腺癌研究发现，ERp29 通过对p38 的信号通路进行负调控，抑制乳腺癌细胞的生长和生存。CSN5 是一种金属蛋白酶复合物，其参与多种细胞的凋亡及增殖。相关研究表示，肿瘤的进展与泛素蛋白酶体密切相关，而CSN5 参与泛素蛋白酶体降解、催化，故认为CSN5 肿瘤关系密切［14］。本研究结果说明CyPJ、CSN5、ERp29 在胃癌患者中恶变程度、侵袭转移中占有重要作用。

同时，为明确影响胃癌患者预后影响的危险因素，本研究对胃癌患者进行为期3年随访发现，患者死亡率为31.30%。相关研究发现，CyPJ 与胃癌细胞增殖和凋亡、细胞周期调节、信号传导有关蛋白相互作用，在肿瘤发生发展过程发挥作用，其水平与胃癌患者两年生存率密切相关［14］。而相关国外研究也显示，ERp29 表达水平可作为胃癌患者疾病程度与预后的生物学标志［15］。本研究予以Logistic回归分析中显示，组织中低分化、TNM 分期：Ⅲ+Ⅳ期、淋巴结转移、ERp29 阴性表达、CyPJ及CSN5 阳性表达为影响胃癌患者预后生存的独立危险因素，与上述研究一致，有力证明了CyPJ、CSN5、ERp29 与胃癌患者关系密切，进一步提示CyPJ、CSN5、ERp29 通过参与肿瘤细胞的分化、浸润和转移影响胃癌患者临床结局。但本研究由于纳入的样本量有限，研究结果有待于通过进一步扩大样本量或多中心合作研究予以进一步证实。

综上所述，CyPJ、ERp29 及CSN5 在胃癌组织中呈异常表达状态，其表达水平与患者的肿瘤临床病理特征及预后有关。