外周血miR-210表达及血清VEGF含量与脑梗死再发的相关性

李颖颖 高岚 王洪新

急性脑梗死是临床常见的心脑血管疾病，以颅内动脉血栓形成或血栓栓塞后神经功能缺血缺氧损害为特征，具有较高的致残率。近些年越来越多的研究认为脑梗死再发是影响脑梗死患者预后的重要因素，准确评估脑梗死病情及再发的风险具有积极临床意义［1-2］。微小RNA（microRNA，miR）是一种具有广泛生物学作用的非编码小分子RNA，在急性脑梗死发病过程中参与炎症反应、细胞凋亡、血管新生等多个环节的调控。MiR-210 在急性脑梗死的发病中起保护作用，有基础研究报道脑缺血缺氧后脑组织中增加miR-210 表达，进而促进血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）生成和血管再生［3］；有临床研究报道，急性脑梗死患者外周血中miR-210 的表达水平明显增加［4］。但miR-210 及VEGF 与脑梗死再发是否具有相关性仍缺乏足够的临床证据。因此，本研究将以首次发生急性脑梗死的患者为对象，随访发病后1年内脑梗死再发的情况并分析外周血miR-210 及血清VEGF 与脑梗死再发的关系，旨在为发现急性脑梗死预后及再发新的评估标志物提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2017年3月至2019年3月期间本院收治的124 例急性脑梗死患者作为研究对象，纳入标准：①符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》［5］中的诊断标准；②首次发病且发病至入院时间＜14 d；③临床资料完整；④可获取随访信息。排除标准：①合并脑出血；②既往有脑肿瘤、脑外伤病史。本研究经医院伦理委员会批准、患者均签署知情同意书。其中男性72 例，女性52 例，年龄49～73 岁、平均（62.38±11.85）岁，发病至入院时间5 h～12 d、平均（2.47±0.52）d。1.2 外周血miR-210 表达水平的检测。

1.2 外周血miR-210 表达水平的检测

入院后采集肘静脉血3～5 mL，采用北京天根公司生产的试剂盒进行miRNA 的提取及检测。首先，按照miRNA 提取分离试剂盒的说明书进行操作，提取外周血中的miRNA；而后，按照miRNA cDNA 第一链合成试剂盒进行操作，将外周血中miRNA 反转录为cDNA；最后，按照miRNA 荧光定量检测试剂盒配置荧光定量PCR体系：cDNA 2 μL、反应预混液10 μL、上游引物（10 μmol/L）0.6μL、通用下游引物（10 μmol/L）0.6 μL、去离子水6.8 μL，在PCR 仪上进行扩增反应，扩增程序为：95℃预变性3 min 后95℃5 s、60℃15 s，40 个循环，根据循环曲线计算miR-210的表达量。

1.3 血清VEGF 含量的检测

入院后采集空腹肘静脉血3～5 mL，静置后离心分离血清，采用酶联免疫吸附法试剂盒（上海西唐科技有限公司）检测VEGF 的含量。

1.4 临床资料收集

根据患者的住院病历收集以下临床资料：年龄、性别、高血压史、糖尿病史、高脂血症史、冠心病史、入院时美国国立卫生院神经功能缺损（National Institute of Health stroke scale，NIHSS）评分、入院时改良RANKIN 量表（modified RANKIN Scale，mRS）评分、空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）。

1.5 脑梗死再发的随访

采用电话回访、门诊复诊等方式进行随访，随访终点为再次出现新发脑梗死，新发脑梗死参照《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》［5］进行诊断，随访截止时间为本次脑梗死发生后1年。根据是否出现再发脑梗死分为再发组和未再发组。

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件及Prism6.0 软件进行统计学分析及制图，计量资料以（±s）表示、组间比较采用t检验，计数资料以n（%）表示、组间比较采用χ2检验，脑梗死再发的预测采用ROC 曲线分析，脑梗死再发的影响因素采用COX 回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 再发组与未再发组miR-210、VEGF 的比较

根据发病后1年是否出现再发脑梗死分为再发组16 例，未再发组108 例。与未再发组患者比较，再发组患者外周血miR-210 的表达水平、血清VEGF 的含量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 再发组与未再发组miR-210、VEGF 的比较（n，±s）Table 1 Comparison of miR-210 and VEGF between recurrence group and non recurrence group（n，±s）

表1 再发组与未再发组miR-210、VEGF 的比较（n，±s）Table 1 Comparison of miR-210 and VEGF between recurrence group and non recurrence group（n，±s）

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2.2 miR-210、VEGF 预测脑梗死再发的ROC 曲线分析

miR-210、VEGF 预测脑梗死再发的ROC 曲线见图1，曲线下面积分别为0.714 和0.8779，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 miR-210、VEGF 预测脑梗死再发的ROC 曲线Figure 1 ROC curve of miR-210 and VEGF in predicting recurrence of cerebral infarction

2.3 脑梗死再发影响因素的COX 单因素回归分析

以脑梗死再发作为应变量，以年龄、性别、高血压史、糖尿病史、高脂血症史、冠心病史、入院时NIHSS 评分、入院时mRS 评分、FBG、TG、TC、LDL-C、HDL-C、miR-210、VEGF 为自变量进行COX 单因素回归分析，结果显示：高血压史、糖尿病史、FBG、TC、LDL-C、miR-210、VEGF 是脑梗死再发的影响因素（P＜0.05）。见表2。

2.4 脑梗死再发影响因素的COX 多因素回归分析

以脑梗死再发作为应变量，以COX 单因素回归分析中有统计学差异的高血压史、糖尿病史、FBG、TC、LDL-C、miR-210、VEGF 作为自变量，进行COX 多因素回归分析，结果显示：高血压史、FBG、miR-210、VEGF 是脑梗死再发的影响因素（P＜0.05）。见表3。

3 讨论

急性脑梗死具有致残率高、复发率高的特点，并且脑梗死复发会影响脑梗死患者预后、增加致残率。国内外关于脑梗死复发的流行病学调查显示，首次发病的急性脑梗死患者1年内脑梗死再发的发生率约10%～16%［6-8］。本研究共纳入124 例首次发病的急性脑梗死患者，发病后1年内脑梗死再发16 例，再发发生率12.90%，与目前关于脑梗死再发发生率的报道基本一致。

表2 脑梗死再发影响因素的COX 单因素回归分析Tanble 2 Cox regression analysis of influencing factors of cerebral infarction recurrence

表3 脑梗死再发影响因素的COX 多因素回归分析Table 3 Cox multivariate regression analysis on Influencing Factors of cerebral infarction recurrence

在临床实践中，早期评估脑梗死再发风险、筛查可能出现脑梗死再发的高危患者并进行干预，有助于预防脑梗死再发、改善脑梗死预后。急性脑梗死发生后，血管新生的激活有利于侧支循环的建立，进而能够减轻神经功能损害［9-10］。MiR-210 在血管新生过程中起调控作用，在脑缺血缺氧过程中miR-210 表达增加且对VEGF 表达、血管新生具有促进作用［3］。有研究在急性脑梗死大鼠中发现，增加miR-210 的表达能减轻大鼠神经功能损害、抑制神经元凋亡，且这一作用与激活VEGF 途径有关［11-13］。以上结果表明miR-210 靶向激活VEGF 在脑缺血缺氧过程中发挥保护作用，脑缺血缺氧过程中miR-210 及VEGF 增多可能是机体自我保护的代偿机制。

虽然miR-210 及VEGF 在急性脑梗死发病中的作用已经受到了越来越多关注，但miR-210 及VEGF 与脑梗死再发的关系尚不清楚。急性脑梗死发生后侧支循环的建立不仅有利于减轻神经功能损害，还能实现远期获益、预防脑梗死再发。本研究在急性脑梗死患者中分析了miR-210、VEGF与脑梗死再发的关系，结果显示：再发脑梗死患者的外周血miR-210 表达水平及血清VEGF 含量明显低于未再发患者；经ROC 曲线进行验证，外周血miR-210 表达水平及血清VEGF 含量对脑梗死再发具有预测价值。以上结果表明miR-210、VEGF与脑梗死再发有关。

近些年陆续有国内学者开始关注脑梗死再发的相关因素及预测标志物，程曼［14］、李友凤［15］、王伟英等［16］的临床研究通过COX 回归模型分析证实了高血糖、高血压、高血脂是脑梗死再发的相关因素，提示严格控制血糖、血脂、血压在脑梗死防治中的积极价值。本研究也在COX 回归模型中分析了脑梗死再发的相关因素，除了发现与既往学者研究结果［14-16］一致的高血压、空腹血糖是脑梗死再发的影响因素外，还发现miR-210、VEGF 也是脑梗死再发的影响因素，由此进一步确认miR-210、VEGF 降低与脑梗死再发有关。

综上所述，急性脑梗死患者外周血miR-210 表达及血清VEGF 含量降低与脑梗死再发有关，检测miR-210、VEGF 对脑梗死再发具有预测价值。