BRAFV600E突变对甲状腺乳头状癌HMGB1及MMP-9表达的影响

张冲 古虎霞 刘定荣 卫惠杰 周丹 方静 杨艳 代晓璐

尽管甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）疾病进展较慢，但因当前对PTC 发生机制尚未完全了解，仍有部分患者治疗后病灶复发或远处转移，这也是PTC 患者死亡的主要原因。研究证实［1-2］，高迁移率族蛋白1（high mobility group protein 1，HMGB1）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）均在PTC 患者中异常表达，且可辅助PTC 的诊断和预后，但其作用机制尚未清晰。HMGB1 已被证实可通过丝裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路影响肿瘤发生、发展。MMP-9 也被认为与肿瘤侵袭、转移相关，既往研究报道［3］，MAPK 可上调MMP-9 的表达。BRAFV600E是MAPK 通路的关键调节因子。结合分析，笔者认为BRAFV600E突变可能与HMGB1、MMP-9 具有关联性，并选取PTC 患者临床资料，进一步阐述其中关联。现将报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月至2019年11月在本院行甲状腺全切除术或次全切除术的116 例PTC 患者。纳入标准：①均经病理学检查证实为PTC［3］；②术前未进行化疗、放疗等抗肿瘤治疗；③临床资料完整，且具有癌组织标本、血清标本；④首次治疗者。排除标准：①合并其他肿瘤；②既往颈部手术史、放射性物质接触史；③合并桥本氏甲状腺炎、甲状腺功能亢进等甲状腺疾病。男52 例、女64 例，平均年龄（53.67±4.80）岁。另择同时期体检正常的30例健康人作为对照组，男13 例、女17 例，平均年龄（54.03±4.85）岁。本研究严格遵守赫尔辛基宣言［4］。

1.2 方法

BRAFV600E基因检测：取连续切片，采用Takara组织/细胞DNA 快速提取试剂盒提取总DNA，采用紫外分光光度计检测DNA 纯度（OD260/OD280为1.6～1.8）；构建PCR 反应体系，进行PCR 扩增，95℃变性15 s、55℃退火15 s、72℃延伸30 s、35 个循环，72℃延伸7 min；产物跑电泳检查纯度后，对PCR 产物进行测序。

组织HMGB1、MMP-9 检测用免疫组化法：取切片，60℃烤片30 min，脱蜡、至水、修复，PBS 冲洗，加3%H2O2溶液，冲洗，滴加一抗（兔抗人HMGB1 抗体、兔抗人MMP9 抗体均购于ABCOM公司）、二抗（羊抗兔IgG 购于北京中杉金桥有限公司），冲洗，滴加DAB 显色剂（中杉金桥有限公司），复染、脱水，透明，中性树胶封片，以PBS 代替一抗作为阴性对照组；由病理科医师盲法阅片［5］，高倍镜下随机5 个视野依照阳性细胞占比分别记“0 分”、“1 分”、“2 分”、“3 分”，低倍镜下观察阳性细胞着色强度分别记“0 分”、“1 分”、“2 分”、“3 分”，以阳性细胞占比及着色乘积判定阳性等级，以积分≤3 分为阴性。Western blot 法：取切片，超声裂解提取上清液，检测蛋白浓度后跑电泳，转膜、封闭、抗体孵育、显影，以管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内参。

采用酶联免疫吸附法检测血清中HMGB1、MMP-9 水平，HMGB1 试剂盒购自于上海振誉生物科技有限公司（规格96T），MMP-9 试剂盒购自于武汉楚锐科药业科技有限公司（规格48T/96T），均由同一组检验人员严格按照说明书检测。

1.3 统计学处理

采用统计软件SPSS 22.0 和Graphpad Prism 软件处理数据；符合正态分布的计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析、独立样本t检验，不符合正态分布采用非参数检验的Wilcoxon 秩和检验；计数资料用n（%）表示，行χ2检验；影响因素采用二元Logistic 分析；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同患者BRAFV600E基因表达情况

116例PTC 患者检出59 例BRAFV600E突变型、57 例为BRAFV600E野生型，PTC 患者BRAFV600E突 变型为50.86%（59/116）。见图1。

图1 PTC 患者组织BRAFV600E基因测序图Figure 1 Tissue BRAFV600E of PTC patients

2.2 组织HMGB1、MMP-9 表达

BRAFV600E突变型HMGB1、MMP-9阳性表达率均显著高于BRAFV600E野生型，差异有统计学意义（P＜0.05）；Western blot法检测结果显示，BRAFV600E突变型HMGB1表达量、MMP-9表达量显著高于BRAFV600E野生型，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2、表1。

图2 组织中HMGB1、MMP-9 表达Figure 2 Expression of HMGB1 and MMP-9 in tissues

表1 PTC 患者组织HMGB1、MMP-9 蛋白表达［n（%）］Table 1 Expression of HMGB1 and MMP-9 in tissues of PTC patients［n（%）］

2.3 血清HMGB1、MMP-9 表达

3 组受试者血清HMGB1、MMP-9 比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。PTC 组BRAFV600E突变型及BRAFV600E野生型血清HMGB1、MMP-9 水平均显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），PTC 组BRAFV600E突变型与BRAFV600E野生型在血清HMGB1、MMP-9 水平上比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 3 组受试者血清HMGB1、MMP-9 比较（±s）Table 2 Comparison of serum HMGB1 and MMP-9 in the 3 groups（±s）

表2 3 组受试者血清HMGB1、MMP-9 比较（±s）Table 2 Comparison of serum HMGB1 and MMP-9 in the 3 groups（±s）

分组PTC 组n突变型野生型对照组F 值P 值59 57 30 HMGB1（pg/mL）8.78±1.66 8.62±1.49 4.56±1.15 90.798＜0.001 MMP-9（ng/L）2.56±0.60 2.39±0.54 1.21±0.26 71.315＜0.001

2.4 PTC 患者临床特征

BRAFV600E突变型TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、有包膜浸润、病灶多发、合并淋巴结转移占比显著高于BRAFV600E野生型，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 PTC 患者临床特征［n（%），（±s）］Table 3 Clinical characteristics of PTC patients［n（%），（±s）］

表3 PTC 患者临床特征［n（%），（±s）］Table 3 Clinical characteristics of PTC patients［n（%），（±s）］

分组性别t/χ2值P 值男女年龄（岁）肿瘤直径（cm）TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期0.336 1.802 1.194 7.767 0.562 0.074 0.235＜0.001包膜浸润25.147＜0.001病灶类型是否单发多发4.806 0.028淋巴结转移是否突变型（n=59）28（47.46）31（52.54）52.71±6.20 1.71±0.33 18（30.51）41（69.49）32（54.24）27（45.76）11（18.64）48（81.36）13（22.03）46（77.97）野生型（n=57）24（42.11）33（57.89）54.60±5.01 1.64±0.30 32（56.14）25（43.86）6（10.53）51（89.47）21（36.84）36（63.16）4（7.02）53（92.98）5.227 0.022

2.5 影响PTC 患者BRAFV600E突变型的因素

以BRAFV600E基因类型作为因变量，以病理特征作为自变量，结果显示合并包膜浸润、多发病灶、组织HMGB1 阳性、组织MMP-9 阳性均是BRAFV600E突变型的独立危险因素（P＜0.05）。见表4。

表4 影响PTC 患者BRAFV600E突变型的因素Table 4 Factors Affecting BRAFV600E Mutant Type in PTC Patients

3 讨论

Reagh 等人［6］的一项荟萃分析研究指出，结直肠癌患者BRAFV600E突变测试与免疫组织化学结果之间具有较高的一致性；余慧等人［7］对黑色素瘤进行分析，结果显示BRAFV600E基因突变患者预后较差。可见，BRAFV600E基因类型对于肿瘤的诊断及预后均有一定的指导意义。BRAFV600E基因类型在甲状腺癌患者中也有类似的效果。郭荣荣等人［8］对甲状腺癌患者超声特征与BRAFV600E基因之间进行分析，结果显示，超声图像特征接触被膜、微钙化、血流丰富等都与BRAFV600E突变存在相关性；Qu 等人［9］指出，BRAFV600E突变是PTC 患者中央淋巴结转移的独立因素，后者是导致患者术后原位复发及二次手术的主要原因。可以说，BRAFV600E突变是PTC 恶性程度以及复发和转移的重要相关因素。

当前认为，PI3K-Akt-mTOR、P53-PTEN、βcateinin 以及MAPK 信号通路与PTC 的发生、发展相关［10-11］，而BRAFV600E基因会通过MAPK 信号通路而对细胞的生长、分化、增殖等进行调节作用参与到PTC 中来。HMGB1 可经“主动”和“被动”释放，这也是本组案例中观察到PTC 患者血清HMGB1 水平显著高于对照组的原因。本组案例结果HMGB1 阳性是BRAFV600E突变型的影响因素。然而，Western blot 法显示BRAFV600E突变型HMGB1 表达量下调，结合BRAFV600E突变型是中央区淋巴结转移的独立因素。这提示，在PTC 患者中，可能BRAFV600E突变下调HMGB1 而增加PTC恶性发展。部分学者认为PTC 患者组织HMGB1表达量下调与自噬功能降低有关［12］。自噬是肿瘤发生初始阶段的应激方式，而在肿瘤进展后期由于肿瘤细胞线粒体功能障碍和代谢缺陷将导致自噬功能下降［13］。对于组织HMGB1 表达量下降的具体机制需要后续工作不断探究。如前所述，BRAFV600E突变是CLNM 的独立因素。Logistic 分析结果进一步证实，组织MMP-9 阳性是BRAFV600E突变型的影响因素。本研究结果发现血清中HMGB1、MMP-9 与组织中HMGB1、MMP-9 不等量表达，但血清HMGB1、MMP-9 对于判定PTC 患者BRAFV600E基因类型是否具有临床意义尚需要进一步观察。尽管本研究显示，组织HMGB1、MMP-9在BRAFV600E突变型、野生型中差异表达，但对于BRAFV600E基因通过哪种或哪几种信号通路以调控HMGB1、MMP-9 的表达需深入研究。另外，本研究未能分析BRAFV600E基因类型对预后的影响，且未能收集甲状腺腺瘤、合并桥本氏甲状腺炎等患者临床资料行更全面的对比研究，这些都有待后续的研究。

综上所述，PTC 患者BRAFV600E突变型和野生型其组织HMGB1、MMP-9 不等量表达，且组织HMGB1 阳性、MMP-9 阳性是BRAFV600E突变型的影响因素。