细胞周期蛋白依赖性激酶4 重组蛋白兔血清抗体的制备及鉴定

慈兴元，王艾俐，叶一鸣，徐思诗，王佳贝，潘依琦，陈俊，张丽芳，赵孔南

温州医科大学分子病毒与免疫学研究所，浙江温州325035

细胞周期蛋白依赖性激酶4（cyclin-dependen- tkinase 4，CDK4）为一类丝 ／ 苏氨酸激酶，定位于染色体的12q13 区域［1］。可与细胞周期素D1（cyclin D1）结合，导致视网膜母细胞瘤基因（retinoblastomagene，pRB）磷酸化，使磷酸化的 pRB 与转录因子E2F发生分离，导致E2F 释放，进而调节细胞周期从G1期转向S 期，促进细胞周期进程［2］。研究表明，CDK4 在多种肿瘤组织及癌细胞中存在过表达及活化，与肿瘤的发生、发展及预后密切相关［3-4］，预示CDK4 可作为肿瘤生物治疗的一个重要靶点［5］。近年来，通过免疫动物制备多克隆抗体，以代替价格昂贵的商业化抗体成为研究热点。

本研究通过基因工程技术构建CDK4 原核表达质粒，并进行原核表达及蛋白纯化，利用重组蛋白免疫日本大耳白兔，制备抗CDK4 兔血清抗体，并鉴定其特异性。为进一步研究CDK4 生物学特性奠定了基础［5］。

1 材料与方法

1.1 标本 CDK4 阳性人宫颈癌组织蜡块由温州医科大学附属第一医院病理科提供。本研究方案获得该医院伦理委员会批准。

1.2 细胞、菌株及载体 宫颈癌Siha 细胞购自中科院上海细胞库；大肠埃希菌 BL21（DE3）菌株及pET21a（+）载体均购自美国Invitrogen 公司。

1.3 主要试剂及仪器 CDK4 商业化多克隆抗体购自美国CST 公司；HRP-羊抗兔IgG 抗体、兔源Histag 单克隆抗体-HRP 及 HRP-山羊抗鼠 IgG（H + L）均购自杭州联科生物技术股份有限公司；IPTG 购自上海杰瑞生物有限公司；镍螯合亲和层析胶购自德国Qiagen 公司；Hoechst 染料购自北京索莱宝科技有限公司；DMEM 培养基及胎牛血清（FBS）均购自美国Gbico 公司；DAB 试剂盒及FITC 标记的羊抗兔IgG 均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Hoechst 细胞核荧光染料、抗荧光猝灭剂及苏木素均购自上海碧云天生物技术有限公司；ELx800 酶标仪购自美国美国Bio-tect 公司。

1.4 实验动物 洁净级健康日本大耳白兔6 只，雌性，12 周龄，体重约 2 kg ／ 只，由温州医科大学实验动物中心提供，合格证号：20190528Cezz0104020995。

1.5 CDK4 基因设计及合成 通过NCBI 数据库查找CDK4 序列，利用生物学软件DNA star V7.1.0 选择B 表位富集序列，并于两端加入酶切位点（NdeⅠ和 XhoⅠ），经密码子优化（http：／ ／ www.detaibio.com ／tools ／）后送北京擎科生物科技有限公司合成。

1.6 重组质粒的构建 将合成的CDK4 序列克隆至pET21a（+）表达载体上，构建重组质粒 pET21a（+）／CDK4。质粒进行双酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒转化至大肠埃希菌 BL21（DE3）中，挑选单克隆，送北京擎科生物科技有限公司测序。

1.7 重组蛋白的表达及纯化 将鉴定正确的菌株接种至 LB 液体培养基中（含氨苄青霉素 100 μg ／mL），37 ℃，250 r ／ min 培养过夜；次日进行 50 倍扩增，继续培养 3 h；加入终浓度 1.0 mmol ／ L 的 IPTG，37 ℃诱导 6 h；250 × g 离心 5 min，收集菌体；柱平衡液（pH 8.0）洗涤，超声破碎，于 8 mol ／ L 尿素中溶解24 h；4 000 × g 离心 5 min，取上清，用镍螯合亲和层析柱进行蛋白纯化，分别用10 mL 的10、50、100、200 mmol ／ L 咪唑洗脱蛋白，并进行 15% SDS-PAGE分析。

1.8 纯化蛋白的鉴定 采用Western blot 法。纯化的CDK4 重组蛋白经15% SDS-PAGE 分离后，转膜45 min；用含5%脱脂牛奶的TBST 室温封闭2 h；加入兔源His-tag 单克隆抗体-HRP（用含5%脱脂牛奶的 TBST 1 ∶10 000 稀释），4 ℃孵育过夜；TBST 洗涤 5 次，5 min ／ 次；加入 HRP-山羊抗鼠 IgG（H + L）（用含 5%脱脂牛奶的 TBST 1 ∶10 000 稀释），37 ℃摇床 2 h；TBST 洗涤 5 次，5 min ／ 次；化学发光显影。洗脱蛋白经 8 mol ／ L 尿素梯度透析，PBS 透析过夜后，于0 ℃冰中保存备用。

1.9 动物免疫 日本大耳白兔6 只，随机分为CDK4免疫组及PBS 对照组，每组3 只，经背部皮下多点注射免疫，隔周1 次，共免疫3 次。首次免疫抗原与等量弗氏完全佐剂混合液，2、3 次免疫抗原与等量弗式不完全佐剂混合液；重组蛋白CDK4 免疫剂量为200 mg ／ 只，对照组免疫等剂量PBS。分别于末次免疫后 0（当天）、2、4、6 及 8 周采集耳缘静脉血，并于第8 周进行心脏采血，分离血清，-80 ℃保存。

1.10 兔血清多克隆抗体效价的检测 采用间接ELISA法。用 20 μg ／ mL 重组蛋白 CDK4 包被 96 孔酶标板过夜；按不同周数及稀释度（1 ∶40、1 ∶160、1 ∶640、1 ∶2 560、1 ∶10 240、1 ∶40 960、1 ∶163 840）加入CDK4 免疫组及 PBS 对照组兔血清，100 μL ／ 孔，每个血清设3 个复孔，加入HRP-羊抗兔IgG 抗体（1 ∶5 000 稀释），37 ℃孵育 1.5 h；TMB 显色，酶标仪检测A450。

1.11 CDK4 兔血清抗体特异性的鉴定

1.11.1 免疫荧光法 在6 孔板中加入细胞爬片，用 Siha 细胞铺板，4 × 105个 ／ 孔，37 ℃培养过夜；用4%多聚甲醛固定细胞，37 ℃15 min；用0.3% Triton-X100 处理，37 ℃ 15 min；PBS 洗涤，加入 20% FBS封闭，37 ℃ 1 h；加入第 8 周的 CDK4 兔血清（1 ∶10 000稀释），同时以PBS 对照组兔血清为阴性对照，CDK4商业化多克隆抗体为阳性对照，4 ℃过夜；PBST 洗涤，加入 FITC 标记的羊抗兔 IgG（1 ∶2 000 稀释），37 ℃ 1 h；PBST 洗涤，Hoechst 染细胞核，抗荧光猝灭液封片，荧光显微镜观察结果并拍照保存。

1.11.2 免疫组化试验 将临床宫颈癌组织标本脱蜡、水化，柠檬酸盐抗原修复3 min；室温自然冷却，PBS 洗涤 3 次，5 min ／ 次；加入 CDK4 兔血清抗体（1 ∶5 000 稀释），以 PBS 对照组兔血清为阴性对照，4 ℃ 14 h；加入酶标羊抗鼠 ／ 兔 IgG 聚合物，37 ℃孵育 30 min；PBS 洗涤 5 次，5 min ／ 次；DAB 显色1 min；苏木素复染1 min；酒精梯度脱水；二甲苯通透15 min；中性树脂封片，显微镜观察并拍照保存。以细胞胞核及胞浆呈棕黄色沉淀判定为阳性显色反应。

2 结 果

2.1 重组质粒的鉴定 重组质粒pET21a（+）／CDK4的双酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，可见526 bp 的目的条带，大小与预期一致，见图1。测序结果表明重组质粒构建正确。

图1 重组质粒 pET21a（+）／ CDK4 的双酶切（NdeⅠ／XhoⅠ）鉴定Fig.1 Restriction map of recombinant plasmid pET21a（+）／CDK4（NdeⅠ／ XhoⅠ）

2.2 纯化产物的鉴定 纯化产物经15% SDS-PAGE分析，可见相对分子质量约19 100 的单一蛋白条带，大小与预期一致，见图2。经Western blot 分析，仅pET21a（+） ／ CDK4 ／ BL21（DE3）菌株能与 His-Tag单克隆抗体反应，在相对分子质量约19 100 处可见单一的蛋白条带，见图3。

2.2 CDK4 兔血清抗体效价 结果显示，免疫组血清第2 周产生CDK4 特异性IgG 抗体，于第8 周血清效价达最高为 1 ∶163 840，见图4。

图2 重组蛋白CDK4 的SDS-PAGE 分析Fig.2 SDS-PAGE profile of recombinant CDK4 protein

图3 重组蛋白CDK4 的Western blot 分析Fig.3 Western blotting of recombinant CDK4 protein

图4 CDK4 兔血清抗体产生时间（A）及效价（B）Fig.4 Time for appearance（A）and titer（B）of rabbit serum CDK4 antibody

2.3 CDK4 兔血清抗体的特异性

2.3.1 免疫荧光法 结果显示，CDK4 血清抗体组及阳性对照组细胞核区域有蓝色荧光，周边区域为绿色荧光，阴性对照组细胞核区域为蓝色荧光，周边区域无绿色荧光，见图5。表明制备的CDK4 抗体能识别Siha 细胞中天然表达的CDK4 蛋白。

图5 CDK4 兔血清抗体特异性的免疫荧光鉴定（× 400）Fig.5 IFA of specificity of rabbit serum CDK4 antibody（× 400）

2.3.2 免疫组化试验 结果显示，制备的兔血清抗体可与宫颈癌组织中的 CDK4 蛋白发生特异性结合，呈阳性显色反应，而阴性对照组中未见棕黄色沉淀，呈阴性反应，见图6。表明制备的CDK4 兔血清抗体能识别宫颈癌组织中表达的CDK4 蛋白。

图6 CDK4 兔血清抗体组（A）及阴性对照组（B）的免疫组化检测（× 400）Fig.6 Immunohistochemical assay of CDK4 antibody in test（A）and control（B）groups（× 400）

3 讨 论

细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）家族有 CDKl ～ CDK7 等成员［6］。其中，CDK4 分子是 CDK 家族中重要的一员［6-7］，能使细胞从G1 期向S 期转化，控制细胞的生长，促进细胞的增殖，即可驱动DNA 的复制且具有引发细胞有丝分裂的双重作用［8-10］。由于CDK4 在调控细胞周期过程中的重要作用，该基因有望用于肿瘤防治的靶标研究。

2001 年，英国NURSE 及HUNT 分别发现了CDK和细胞周期蛋白（cyclin），为进一步研究肿瘤的发生、发展以及早期诊断和治疗提供了新思路［10-11］。周勋［12］通过筛选获得稳定表达NLS-AK 的MDAMB-231 细胞株，通过划痕及Transwell 等试验分析，为胞内CDK4 抗体在肿瘤基因治疗中的应用提供了相应的实验依据。因此，CDK4 是目前癌症防治研究中的重要蛋白之一。

目前，单克隆抗体由于其纯度高及特异性强，在肿瘤和感染的诊断及治疗研究方面具有无可比拟的优越性［13］。利用动物免疫方法获得的多克隆抗体制备技术简单，成本较商业化抗体低廉，且所获得的抗体具有效价高且特异性强的特点，可提高检测的准确度及灵敏度。因此，多克隆抗体在肿瘤及感染的诊断和治疗研究方面也具有一定的应用价值及应用前景［14-15］。

本研究将人细胞中CDK4 基因，通过原核密码子优化后经原核表达，制备了具有较强抗原性的重组蛋白CDK4，免疫日本大耳白兔后制备CDK4 特异性兔血清抗体，第8 周即可获得高效价的兔血清抗体，效价达1：163 840。通过细胞免疫荧光及免疫组化试验鉴定，所制备的兔血清抗体具有能特异性识别天然CDK4 蛋白的特性。

本研究通过原核表达系统成功制备了重组蛋白CDK4 及其特异性的兔多克隆抗体，为CDK4 相关生物学及免疫学研究奠定了基础。