畜禽养殖场抗生素耐药基因残留及传播研究进展

陈颖欣，陈佳华，张志瑾，冯锦涛，梅 亮，王 燕

(华南农业大学 动物科学学院，广东 广州 510642)

自21世纪初起，世界卫生组织(World health organization，WHO)将抗生素耐药基因(ARGs)定义为一种新型的环境污染物[1]。据统计，欧盟每年因感染携带多重ARGs的细菌而死亡的人数多达25 000人，而美国每年多达23 000人[2]。由于集约化畜牧养殖业与饲料业的发展，兽用抗生素广泛应用于畜牧养殖业，2013年中国抗生素使用量高达16.2×104t，约占世界总用量的一半，其中52%为兽用，且有逐年增长的趋势[3]。抗生素在动物体内不能被完全吸收代谢，约40%～90%以原药或异构体的形式随畜禽粪尿排出体外[4]。这些抗生素进入环境后会对环境生物构成威胁，加速环境中ARGs的产生和传播。研究表明，养殖场及周边环境采集样本可检出上百种ARGs，其中部分表达水平甚至是对照样本的上万倍[5]。因此，畜禽养殖场ARGs受到越来越广泛的关注。本文在总结目前养殖场抗生素ARGs的种类及来源的基础上，综述了养殖场兽用抗生素ARGs的残留以及扩散规律，并阐明了影响兽用抗生素传播的相关影响因子，为减少养殖场的ARGs传播提供数据支撑。

1 畜禽养殖场ARGs种类及来源

1.1 畜禽养殖场ARGs的种类

目前，研究发现的畜禽养殖场ARGs种类繁多。按耐药种类划分，主要有四环素类、磺胺类、大环内酯类、β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、氯霉素类等[6-7]。四环素类ARGs是国内外研究较多，已发现种类达四十多种的一类ARGs，主要包括金霉素、土霉素、四环素等。磺胺类ARGs不仅是ARGs中在养殖场普遍检出的，而且是性质上较为特别的一类——若细菌对一种磺胺类抗生素产生抗药性，则其具有所有该类抗生素的耐药性[8]，主要包括磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶等。

不同类ARGs其抗生素失活机制不同，同类ARGs也会存在不同的抗生素失活机制。按ARGs的耐药机制，ARGs种类主要有抗生素酶解作用机制、核糖体保护蛋白机制、降低细胞膜通透性机制、外排泵机制、药物靶标位点突变机制及其他或未知机制[2，9-10]：抗生素酶解机制是一类钝化或灭活抗生素酶的基因，如四环素类酶修饰基因tetX[8]。核糖体保护蛋白机制以核糖体保护蛋白结合核糖体导致核糖体构型的改变，该过程由三磷酸鸟苷(GTP)水解提供能量，如tetM、tetO、tetS、tetT、tetQ等[2]；降低细胞膜通透性机制可以通过对细胞外膜脂质 A 进行氨基阿拉伯糖修饰，例如mcr-1等[11]；或选择性地减少外膜孔蛋白的数量、改变外膜孔蛋白的大小、增加细胞壁的厚度，来降低自身细胞膜的通透性，使得抗生素无法通过菌体的外膜，从而导致细菌对某些抗生素产生抗性[2，12]；外排泵机理包括tetA、tetB、tetC、tetD、tetG等，则通过存在于细胞膜上的一类蛋白将抗生素泵出胞外而产生耐药作用，被认为是微生物适应环境胁迫条件的主要途径[13]；药物靶标位点突变机制的细菌体内存在许多与抗生素结合的靶标位点，不同种类抗生素的作用靶点不同，细菌可以通过改变相应的作用靶点，使抗生素与细菌不易结合而产生耐药性，如细菌可以通过改变β-内酰胺类药物的作用位点——细菌的青霉素结合蛋白(PBP)，使得β-内酰胺类抗生素不能与之结合从而实现对β-内酰胺类抗生素的耐药等[14]；还有多种其他或未知机制，如tetU、ortC等。其中，酶解作用机制和外排泵机制是养殖场土壤中ARGs的主要耐药机制[2，10，15]。另外，除单一耐药类和单一耐药机制的ARGs，还有倍受关注且多为临床所见的对多重抗生素耐药或具多重耐药机制的的ARGs，其具有更高的多样性及更大的防治难度。如编码产超广谱β-内酰胺酶 (Extend-spectrum-β-lactamases, ESBLs)的基因大多在一个较大的质粒上,该质粒常携带ARGs,因此ESBLs的菌株多数为多重耐药菌[16]；程建华等[17]在紫色土丘陵区三种养殖场土壤中检出各类型ARGs中，ARGs的丰度最高，达6.04×107～1.15×109copies/g。总而言之，目前发现的ARGs极富多样性，而且仍有不少ARGs其失活机制仍待进一步研究。

1.2 畜禽养殖场ARGs的来源

畜禽养殖场抗生素ARGs的产生一般来自两个方面。一是天然存在的ARGs，这主要是由于某些微生物在产生抗生素的同时也具有相应的耐药机制[18]，使得环境中存在着天然的ARGs[19]。另一种来源是基因突变。研究人员认为抗生素过量使用产生了选择压，加剧了对ARGs的选择，并促进ARGs的富集，让许多原本不具备ARGs的微生物获得了新的ARGs。

养殖场建址的自然环境中存在天然的ARGs，这些基因早在人类使用抗生素之前便已出现。有研究报道表明，β-内酰胺类、四环素类、糖肽类等ARGs在人类使用抗生素之前就在自然环境中存在[19]。同时，养殖场内饲养的畜禽体内的微生物也可能携带ARGs，Thames等[20]在从未摄入抗生素小牛的粪便中检测出四环素相关ARGs。有研究者猜测环境中存在的原始ARGs可能来自产抗生素的细菌，并进一步分析发现，产抗生素细菌的原始ARGs最初发挥着非耐药功能，如一些细菌ARGs表达的β-内酰胺酶最初用于参与肽聚糖的修饰[21]。研究人员曾在未经人为因素干预的土壤和沉积样品中发现并提取出具有天然的ARGs的微生物[21]，依靠宏基因组学相关技术，发现了独特的ARGs库，有ARGs的前体基因[22]。自然条件下多数ARGs处于隐形状态，但适当的环境压力可使前体基因进化为ARGs，抗体基因也可能在特殊条件下表达。

抗生素的使用，促进了对第二种来源——基因突变产生的ARGs的选择。抗生素含量水平可对动物肠道和粪便中的细菌ARGs产生一定的选择压力[23]，同一水平的选择压可能同时诱导多种ARGs富集，当选择压较高时，还可在短期内促进细菌形成新品种。研究表明,用金霉素饲喂肉牛会导致粪便中E.coli和肠球菌的耐药率明显增加[18]。在仔猪饲养中，口服与注射氨苄西林(20 mg/kg body weight)会显著提高粪便中肠杆菌科细菌耐药性，口服抗生素会使粪便中blaTEM拷贝数从104～106copies/g升高至107～109copies/g，耐药率从0.9%～12%提高至40%，而注射抗生素的耐药率则会升高至26%，但注射对粪便中的ARGs无明显影响[24]。

2 养殖场ARGs残留现状

2.1 养殖场粪便中的ARGs残留

粪便是养殖环境中ARGs的主要蓄积库。研究表明，在畜禽养殖中添加亚剂量水平的抗生素会增加粪便中抗生素残留和ARGs丰度[25]。磺胺类ARGs和四环素类ARGs在粪便中较常被检测到。Xu等[26]分别从上海研究区代表性猪场、禽舍和养牛场进行粪便取样，结果显示在所有粪便样品中均检测到了磺胺类(sul1,sul2,sul3和sulA)和四环素ARGs(tetB(P),tetM,tetO,tetW)，磺胺类ARGs相对丰度呈以下趋势sulA>sul1 >sul2 >sul3，四环素类耐药基因的趋势为tetM>tetW>tetO>tetB(P)。此外，关于氯霉素类ARGs和大环内酯类ARGs等也较常在粪便中被检测到，何良英等[18]选取华南6个山地放养型鸡场，5个室内平养型鸡场进行粪便取样，对常见ARGs进行检测，其中5个氯霉素类ARGs(fexA、fexB、cfr、cmlA、floR)、4个四环素类ARGs(tetM、tetQ、tetS、tetW)和2个磺胺类ARGs(sul1、sul2)在所有粪便样品中均被阳性检出，检出率较高的ARGs为fexA、cfr、cmlA、sul1和sul2，其次为fexB、floR、tetO。刘菲[27]对常州市2处肉鸡饲养区域进行取样，其中所研究的6类21种ARGs在粪便样品中均有分布，测得磺胺类ARGs、大环内酯类ARGs、四环素类ARGs的绝对丰度分别为2.29×106～3.37×1011copies/g、2.05×105～2.16×1010copies/g、1.14×104～2.23×1010copies/g。

2.2 养殖场空气中的ARGs残留

在养殖场空气中，四环素类、磺胺类、大环内酯类、β-内酰胺类和喹诺酮类等ARGs都曾被研究学者检测到。金明兰等[28]对吉林省某8家养殖场进行空气取样，共分离360株E．coli，通过PCR方法对选取的磺胺类ARGs(sul1、sul2、sul3)进行检测，共检测到163个ARGs，其中sul1、和sul2检出率较高。高敏等[29]研究表明，鸡场空气中四环素类ARGs浓度较高。刘长利等[30]对某养猪场空气大环内酯类ARGs(ermA、ermB、ermF)和四环素类ARGs(tetW)进行检测，测得大部分目的基因浓度为104～107copies/m3，其中ermB、ermF、tetW浓度较高，为106～107copies/m3。

2.3 养殖场土壤中的ARGs残留

大量养殖场ARGs随着施肥等人类活动进入土壤。李晓华[23]选择12个省的13家规模化生猪养殖场周边进行土壤收集，通过荧光定量PCR技术对4类17种常见ARGs进行检测，除ermB、qnrA、qnrB三种基因外，其他ARGs在土壤样品中的检测率为100%，土壤中tetA、tetX、tetG、sul1、ereA和qnrB等ARGs丰度值较高。Zhao等[31]对河南地区养猪场土壤环境中氟苯尼考类ARGs进行研究，发现氟苯尼考类ARGs整体污染水平较高，其中fexA、optrA和floR在所有的样品中均被检测到，floR平均相对丰度最高，其次是optrA。Mu等[32]对北方多个养殖场进行土壤取样，对四类常见ARGs进行检测，21种ARGs在大多数样品中都被检测到，其中大环内酯类ARGs(ermB、ermC)、磺胺类ARGs(sul1、sul2)、喹诺酮类ARGs(qnrS、oqxB)和四个四环素类核糖体保护蛋白ARGs(tetO、tetQ、tetM、tetW)在所有样品中均被检测到，在土壤中含量最多的是sul1和sul2，分别为(2.21±1.34)×10 copies/g和(1.01±0.56)×10 copies/g。

2.4 养殖场养殖废水的ARGs残留

Tao等[33]在6个猪场废水处理系统中，tetA、tetW、sul1、sul2、blaTEM在所有样品中均被检测到，且磺胺类ARGs平均相对丰度最高，其次是blaTEM，四环素类最低。李晴等[34]对养殖场附近污水处理厂进行水样采集，对分离所得的产ESBL大肠杆菌(escherichiacoli,E.coli)进行ARGs检测，检测到blaCTX-M、blaSHV、blaTEM等ARGs，其中blaTEM检出率为100%。何良英[18]研究发现，鸡场废水中的优势基因有fexA、floR、sul1、sul2和tetG，而猪场废水中的优势基因有tetA、tetH、ermE、sul2、sul1、tetG、fexA、ermB、tetO、tetW。

3 畜禽养殖场ARGs扩散与传播

3.1 养殖场ARGs的扩散途径

ARGs在某些条件可稳定存在并扩散，微生物是ARGs扩散的载体，广泛存在于畜禽体内及外部环境中。畜禽体内微生物携带的ARGs通过粪污排放进入周围环境中并得以进一步扩散(图1)。ARGs在养殖场及周边环境中主要有三个扩散途径，分别为通过空气及接触扩散、粪污还田进入土壤、渗透作用进入地下水。

图1 养殖场ARGs传播途径[24，36-37]Fig. 1 Dissemination of ARGs in the livestock farm

研究发现，养殖场细菌种类多为环境正常菌群及条件性病原菌，其中存在较多对青霉素类、喹诺酮类、磺胺类、氨基糖苷类等人畜共用抗生素耐药的菌株[37]，其来源主要是畜禽粪便排放后，肠道内的微生物会负载到细颗粒物(particulate matter,PM)形成细菌气溶胶并通过空气扩散。另一方面养殖场工作人员暴露在空气中，直接接触了空气中可能携带ARGs的微生物，ARGs得以向外界扩散或者进入人体引发疾病。

粪便中携带ARGs的微生物可随着粪便还田进入土壤，并在土壤中进一步迁移扩散。Muziasari等[38]发现鱼类养殖场沉积物中富集ARGs，并在鱼的肠道中检测出28种ARGs，猜测动物的粪便能促使ARGs在周围环境中扩散。长期施用鸡粪的土壤中检出ARGs种类比对照土壤中ARGs种类更多[39]。Peng等[40]研究发现，在长期施用猪粪的土壤中检出25种ARGs，而在所施用的粪肥中检出ARGs有32种。研究说明养殖动物体内的ARGs会随着粪便还田进入土壤，造成ARGs污染的进一步扩散。

随着养殖污水排放至江河中，ARGs借此扩散到水体，下渗进入地下水。在养猪场纳污河流中，出水点检测出高水平多样化的ARGs，说明养殖污水排放后，其中携带的ARGs进入新环境会促进其变迁[18]。动物排泄物随废水进入水体中造成抗生素的扩散，并进一步诱导ARGs发生变异(表1)。更为严重的是，ARGs可能随着下渗的地下水，进入人类的饮用水中。已有多个国家报道, 包括自来水、再生水、地表水等，在多种水体均能不同程度地检测出耐药菌和ARGs污染[41-42]。研究检测发现，天津市自来水中存在存在抗四环素类、β内酰胺类、磺胺类和氨基糖苷类四类抗生素的ARGs[43]。可见ARGs可能会通过自来水等途径向人类传播，引起的健康安全隐患不容忽视。

表1 四环素类抗生素及ARGs相关度分析结果[44]Table 1 Correlation analysis on Tetracycline antibiotics and ARGs

3.2 养殖场ARGs的传播方式

微生物ARGs的传播分为两个途径，垂直转移和水平转移。某些细菌的染色质内存在天然的ARGs，微生物在增殖过程中染色质固有ARGs得到复制而世代传递，称之为垂直转移(vertical gene transfer, VGT)。通过调查山东肉鸡场中分离的大肠杆菌耐药谱及脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)，对比PFGE与ST型均相同的菌株，发现菌株既有同年份同地区同养殖场的，也有不同年份的，说明大肠杆菌分离菌株存在垂直转移和水平转移[45]。

另一方面，在环境中抗生素的压力下，微生物利用各类移动元件(mobile genetic element，MGE)如整合子(integrons，In)、质粒、转座子(transposons，Tn)等的接合转移、转导及转化等方式来获取环境中的ARGs[46]，称为基因的水平转移(horizontal gene transfer，HGT)。

VGT只能使ARGs通过母传子的方式在同种属微生物中世代传递，而HGT则能实现不同菌属之间ARGs的扩散与交流。HGT主要依靠各类移动元件在微生物之间、环境与微生物间传递基因，而在人类活动的影响下，促进MGE的出现，加剧了HGT，导致ARGs扩散交流并出现了多重耐药菌株。

HGT依靠各类移动元件如耐药性质粒、In、Tn、整合性MGE和基因岛等，通过转化，接合、转导的方式传递基因。

耐药性质粒又称R质粒，其组成单元之一的耐药性决定因子赋予细菌特定抗生素的耐药性[47]。R质粒能够携带In、Tn来收集捕获环境中的ARGs[47]，累积ARGs并通过转化、接合、转导、转座或移位等转移方式使多种ARGs共同传播[48]。临床中常见的革兰氏阴性菌对磺胺类药物ARGs多是质粒携带ARGs而导致的获得性耐药[18]。Tn是可从细菌基因组上一个位点插入到另一个位点上的遗传因子，有些Tn会携带ARGs，在基因间跃迁的过程中实现ARGs的转移[48]，其转座过程是Tn的一个拷贝仍留在原位点，新的拷贝插入在“靶点”上，新型Tn-554家族转座子Tn-6674携带了spc、erm(A)等多个ARGs[49]。利用转座子遗传标记基因，在耐药大肠埃希菌中tnp513检出率为75%，试验证明ARGs被检出在或者质粒(fex-B、cml-A、cfr、flo-R)等移动元件上[49]。

In通过编码整合酶来捕获细胞外的游离基因并整合到基因盒子(gene cassettes，GCs)中，携带GCs插入到其他可移动元件在细菌间传播ARGs，并可为游离基因提供启动子使其在细胞内表达[50]。转移方式为转化、转导、接合等。何良英等[18]试验结果表明，肉鸡养殖场及其受纳环境中ARGs的扩散与In相关。

此外，如整合性结合元件(integrative and conjugative element，ICE)、基因岛(genomic island， GEI)等新的基因水平转移元件在ARGs的水平转移中发挥着重要作用。由于自然界生物细胞的裂解释放，携带ARGs的裸露DNA分子在一定条件下可在环境中持续存在[51]，特定条件下环境中细菌之间发生基因水平转移，细菌通过吸收游离的DNA分子获得ARGs[51]。Heather等[12]研究表明携带了ARGs的MGE能转移到人类的共生菌与致病菌中，对人类造成威胁。

4 ARGs扩散和传播影响因素

4.1 光照

在黑暗条件下有利于抗生素传播，ARGs与宿主细胞很难发生光解，研究人员利用实时定量PCR技术在实验室模拟监测了编码四环素的ARGs(tetO、tetW、tetM、tetQ)以及宿主细菌在水中的归趋，结果光照处理组ARGs的一级消减系数(kd)为-0.75至-0.84 d，黑暗处理组ARGs的一级kd为-0.49 d。Knapp等[52]2008年利用中宇宙的方法发现四环素ARGs(tetO、tetW、tetM、tetQ、tetB、tetL)在光照处理下kd为-0.72 d，黑暗处理下kd为-0.51 d，最终发现黑暗处理下ARGs的kd值显著大于正常光照处理下的kd值。Kd值增大，ARGs含量减少，能传播的ARGs因此也减少。

4.2 温度

在高温条件下不利于抗生素传播， ARGs降解速度会加快。 Pei等[53]在研究牛奶厂废水中ARGs对于生物处理的反应中发现，两种四环素ARGs(tetW、tetO)两种磺胺类ARGs(sul1、sul2)在20 ℃处理后的含量显著小于4 ℃处理后的含量。ARGs含量减少就能降低ARGs传播的可能性。潘寻等对高温堆肥中不同温度处理的四种抗生素( 磺胺二甲嘧啶、土霉素、金霉素、泰妙菌素)定量分析，研究发现高温堆肥能有效去除抗生素[54]。四种抗生素中，最高温度为43和68 ℃处理28 d堆肥结束时，磺胺二甲嘧啶去除率增加2%，土霉素去除率增加13%，金霉素去除率增加8%，泰妙菌素去除率增加14%。 抗生素滥用是导致ARGs产生的原因，一旦抗生素去除，畜牧场内外环境微生物菌体和畜牧体内微生物菌体产生ARGs的可能性减少。

4.3 氧气

在厌氧条件下ARGs降解速度加快。Pei等[53]研究发现，四环素ARGs(tetW、tetO)与磺胺类ARGs(sul1、sul2)在厌氧处理后的含量显著小于4 ℃处理后的含量。ARGs含量减少就能降低ARGs传播的可能性。

4.4 重金属

重金属可以影响ARGs的传播。重金属与抗生素的组合作用一共有三种情况[55]。(1)低浓度的重金属与抗生素为协同抗性，高浓度重金属与抗生素为协调杀菌。如Cr6+和Zn2+与红霉素的作用;(2)与1相反，高浓度的重金属与抗生素为协同抗性，低浓度重金属与抗生素为协调杀菌。如Cr6+和Zn2+与阿莫西林的作用;(3)只与共存重金属种类有关。如Cu2+的共存导致菌体的四环素抗性减弱，类似情况还有Cu2+与阿莫西林，Cr6+与头孢，敏感性从耐药变成敏感，而Cu2+的共存导致菌体的红霉素抗性明显增强，敏感性从中介变成耐药。李晓华[23]研究表明，粪便、土壤和污水中的ARGs和抗生素水平并不存在明显的线性相关关系，这表明除抗生素诱导外，土壤中还存在其他因素影响ARGs的扩散传递。已有研究表明，土壤中重金属含量与抗生素可对ARGs产生共同选择效应[24]。Zhu等[56]发现，土壤中ARGs浓度与重金属含量成正相关。故猜测抗生素浓度及重金属含量等因素共同作用影响ARGs在土壤中传播。另外，土壤的常规理化性质也可能对ARGs起共同选择作用，但详细机理还有待研究。

4.5 环境介质

不同的环境介质也会影响抗生素的传播，从而诱导不同的ARGs，也会直接影响ARGs的传播。磺胺类和氟喹诺酮类是水介质中最常残留的抗生素，沉积物和土壤也常残留着四环素、磺胺类和大环内脂类抗生素等[57]。在空气中，细菌气溶胶化的程度会影响空气介质中ARGs的丰度[58]。Gao等[59]分别研究了蛋鸡及肉鸡养殖场空气中的四环素类ARGs，对比发现两种养殖场中ARGs丰度都与PM的直径成正相关。调查显示，在养殖场周边环境中，比起上风向测定的PM相比，下风向中PM包含的四环素类ARGs更为丰富，说明AGRs在养殖场周边的扩散受风向影响。

5 展 望

养殖场ARGs的出现及广泛传播，使得各类微生物耐药率不断提高，耐药谱扩大，导致各类抗生素的作用明显减弱。畜禽粪便与废水是ARGs的重要蓄积库，畜禽粪便与废水中的ARGs不仅可进行水平转移，而且具有垂直传播功能。对粪便废水的充分处理或资源化利用，使耐药菌和ARGs灭活，有效减少甚至避免养殖场ARGs的扩散，也是今后研究的方向。总之，对于ARGs的种类、来源、传播及影响因素的研究在国内的研究仍待深入，其能有效帮助对ARGs的整治，促进畜牧行业的健康发展，保障畜牧产品在生活中的安全使用。