始丰微型牛体型与外周血cAMP、PTH和TGF-β水平关联性分析

冀德君 ，张 威，许 静，程 牧

(1.扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009；2.盱眙县动物卫生监督所，江苏 淮安 211700)

始丰微型牛是我国浙江省地方品种天台黄牛的一个小型类群。天台黄牛分布在浙江省台州市天台县及其周边地区，其出生时体型小，当地俗称“小狗牛”，属肉役兼用型的地方特色品种。黄牛体型大小的形成与遗传特性、生长激素轴、性轴等的调控有关[1]。生长相关激素调控是生长发育过程中必不可少的环节，通过细胞合成与分泌激素物质进入血液循环，在不同的组织发挥相应生理作用，从而对生长发育起调节作用。与体型大小形成最为密切相关的是骨骼的生长发育调控，涉及环磷酸腺苷(cAMP)、甲状旁腺素(PTH)和转化生长因子β(TGF-β)等因子。cAMP具有调节神经递质合成，促进激素分泌的作用[2]。一些二级促激素促进次级激素合成是通过cAMP途径调节的。cAMP能诱导GH的释放，使代谢酶活性增强，从而促进肝脏内蛋白质、DNA和RNA的合成[3]，并激活IGF1，促进机体的合成代谢、增殖骨骼生长和其他一些生物学的变化[4]，增快动物的生长速度。PTH是调节血钙水平的最重要激素，它有升高血钙和降低血磷含量的作用，其调节骨的合成、分解代谢，对骨形成和骨吸收具有双重效应，持续大剂量PTH 促进骨吸收，间歇性小剂量PTH 促进骨形成。另一方面，PTH对靶器官的作用是通过cAMP系统而实现的。PTH对骨样细胞细胞膜上的受体结合，活化腺苷酸环化酶，使细胞cAMP浓度增加。在PTH作用下细胞cAMP含量升高是成骨细胞的典型表现之一[5-7]。Bllow等[8]认为PTH 对鼠颅骨细胞的作用依赖于成骨母细胞分化的程度，PTH 刺激鼠颅骨细胞cAMP合成的高低与细胞的分化程度相一致。PTH刺激破骨细胞吸收骨基质释放TGF-β1，释放的TGF-β1促使骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞，从而增加骨形成[9]。TGF-β1在骨质中大量存在，并由破骨细胞激活和释放，是骨生成的关键调节者，也是体型大小形成的重要基础。

本研究在普通体型天台黄牛和始丰微型牛群体中，对骨骼生长相关的cAMP等指标进行测定分析，以获得始丰微型牛的基础生理生化信息，并尝试对始丰微型牛体型形成机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 试验动物

本研究采用的微型牛和较大体型天台黄牛来自浙江省天台县天台黄牛保种场，选取13～16月龄的健康始丰微型牛9头(♀6♂3)和较大体型天台黄牛9头(♀6 ♂3)。

1.2 样品采集与处理

早上空腹(禁食一晚，不禁水)，每头牛无菌颈静脉采血5 mL，加EDTA 抗凝，4 000转/min离心，取上清，4 ℃保存，及时转移至实验室检测分析。

1.3 ELISA测定

针对生长发育相关因子cAMP、PTH和TGF-β，采用商用ELISA试剂盒(上海研瑾生物公司)进行测定。首先稀释ELISA试剂盒内各标准品，在酶标包被板上设定空白孔、标准孔和待测样品孔，在标准品孔中准确加样50 μL，待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，然后再加待测样品10 μL，倍比稀释后轻微振荡，封板膜封板后置37 ℃温育30 min。然后洗涤5次，拍干。接着加入HRP酶标试剂50 μL，空白孔除外，重复温育、洗涤步骤，最后加入底物溶液(TMB)50 μL，轻轻震荡混匀，覆膜，37 ℃ 避光显色15 min后，每孔加终止液50 μL，终止反应，酶标仪(Labsystems MultiskanMS-352，芬兰)进行450 nm波长测量测定OD值。

1.4 数据处理

依据酶标仪测定数据，用SPSS 17.0 统计软件对实验数据进行统计分析，用独立样本T检验进行统计分析不同体型组间三个指标的差异。

2 结果与分析

2.1 公牛不同体型间三个因子含量的比较

由图1可知，微型牛组公牛TGF-β含量(185.9 ng/L)极显著低于对照组(236.6 ng/L)(P<0.01)，cAMP含量(11.4 ng/L)显著低于对照组(12.6 ng/L)(P<0.05)，甲状旁腺素(PTH)含量两组间差异不显著(P>0.05)。说明促生长相关因子水平对公牛体型大小的形成有影响。

图1 公牛不同体型间三个因子含量的比较*表示差异显著(P<0.05), **表示差异极显著(P<0.01)Fig.1 Comparison of blood biochemical indice between miniature and normal body size of bulls* represents significant difference(P<0.05),** represents extremely significant difference(P<0.01)

2.2 母牛不同体型间三个因子含量的比较

由图2可见，微型牛组母牛TGF-β含量(195.9 ng/L)显著低于对照组(226.0 ng/L)(P<0.05)，其cAMP含量(13.97 ng/L)和甲状旁腺素(PTH)(209.23 ng/L)含量和对照组(cAMP 13.52 ng/L；PTH 191.47 ng/L)间差异不显著(P>0.05)。说明雌激素等性别相关因素可能干扰促生长相关因子的水平，进而一定程度上影响了母牛生长发育。

图2 母牛不同体型间三个因子含量的比较*表示二者差异显著(P<0.05)Fig.2 Comparison of blood biochemical indice between miniature and normal body size of heifers* represents significant difference(P<0.05)

2.3 不分性别不同体型间三个因子含量的比较

不分性别微型牛组TGF-β含量(192.6 ng/L)极显著低于对照组(229.5 ng/L)(P<0.01)(图3)，其cAMP含量(13.1 ng/L)和甲状旁腺素(PTH)(205.8 ng/L)含量和对照组(cAMP 13.2 ng/L；PTH 203.8 ng/L)间差异不显著(P>0.05)。说明不同体型群体在遗传上存在差异的TGF-β水平，可能是导致不同体型分化生长结果的起因。

图3 不分性别下不同体型间三个因子含量比较**表示二者差异极显著(P<0.01)Fig.3 Comparison of blood biochemical indice of different genders with different body size** represents extremely significant difference(P<0.01)

3 讨 论

正常的生理生化指标，既能反映动物体内实质与外表性能之间的关系，也能反映品种、性别、年龄、地区、不同外界环境及不同生理状况的特征[10]，有必要将血液生理生化指标的变化与生态环境、生产性能充分结合开展研究。甲状旁腺激素(PTH)主要的作用是维持血钙平衡，而血钙浓度反过来又可以调节 PTH 的分泌，在组织中表达使得cAMP含量升高。另外，PTH 也可以通过调节骨生长因子(如 IGF-1)和生长因子抑制剂等来间接地调节骨的生长，如 PTH 可以通过诱导 IGF-1 与成骨细胞结合达到促骨形成的作用[11-12]，其中cAMP是细胞内参与调节物质代谢和生物学功能的重要物质，是生命信息传递的“第二信使”。甲状旁腺素(PTH)是由甲状腺主细胞分泌的一种84肽激素[13]，是调节钙、磷代谢的主要生物活性物质，可促进骨钙代谢、小肠对钙的吸收[14]及远曲小管对钙的重吸收，使血钙升高，同时抑制近曲小管对磷和碳酸氢钠的重吸收，使尿磷排出量增多，血磷下降。其分泌量增加，会使血钙浓度上升，从而促进骨形成和骨吸收，完成增加骨量[15-16]。Ferrari等[17]认为，β-Arrestins可能通过限制PTH诱导破骨细胞生成，限定了间歇性的PTH对骨骼的活性；另一方面，Arrestins可激活磷酸二酯酶，促进cAMP的降解，通过cAMP/PKA调节PTH成骨作用。TGF-β在机体生长发育中起着重要作用，可以调节成骨细胞的增殖和分化以及破骨细胞的活性。而PTH则通过PKC通路调控TGF-β1的表达以及通过PKA通路调控TGF-β2的表达[18]，PTH刺激破骨细胞吸收骨基质释放TGF-β1，释放的TGF-β1促使骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞，从而增加骨形成[19]。PTH-Smad3通过抗凋亡作用来扩大TGF-β对成骨细胞的合成代谢效应，提示TGF-β 信号与PTH信号存在相互作用[20]。

本文研究的始丰微型牛，系经长期自然选择和人工选育而形成的山地型小个体黄牛，是一个肉役兼用型地方品种。通过研究始丰微型牛的三项生化指标环磷酸腺苷(cAMP)、甲状旁腺素(PTH)、与转化生长因子β(TGF-β)，并对其进行分组比较分析，发现转化生长因子β(TGF-β)在微型牛和正常体型黄牛间存在显著差异，结果说明了TGF-β在体型形成中发挥着重要影响。由于本研究只涉及单个牛品种且样本量较小，因此结果不能完全反映三个指标在不同体型群体中的实际差异情况，特别是cAMP和PTH，很可能存在性激素和营养、环境等因素的干扰，使得cAMP和PTH在遗传上的差异不能体现。总体而言，始丰微型牛的体型和早期低水平促生长相关激素有直接关系，深入研究将会揭示始丰微型牛生长受阻的具体机制，为进一步的深入研究揭示始丰微型牛的生物学特性提供基础数据及背景资料。

4 结 论

本研究结果表明，TGF-β在微型牛体型形成中发挥着重要影响，cAMP含量在公母牛上的影响有差异。