5p15缺失综合征合并4q32重复1例临床分析与基因诊断

刘舒 韦思思 张也 欧阳海梅 梁金群 陈暖 陆鹤云 曾伟宏 江剑辉

(1.广东省妇幼保健院 儿童遗传代谢与内分泌科，广东 广州 511442；2广东省妇幼保健院医务科，广东 广州 511442)

5p缺失综合征，又叫猫叫综合征(Cri du Chat syndrome，CDCS，OMIM#123450)，是由人类5号染色体短臂(5p15为核心区域)缺失所引起，是临床上相对少见的常染色体缺失综合征，由Lejeune[1]于1963年首次报道，其发生率在新生婴儿中约为1/15 000～1/50 000，在智力障碍人群中，可达1∶350[2]。典型猫叫综合征患者的临床表型包括出生后严重生长发育迟缓、猫叫样哭声、小头畸形、满月脸、宽眼距、内眦赘皮、大鼻梁、低耳位、小下颌、高额弓、低出生体重、严重的智力落后等，并可能伴有先天性心脏病等多种表型改变[3,4]。4q32重复常发生以智力及生长发育障碍、面容异常为主的一系列症状，根据染色体重复区域的大小不同，临床表现有所不同[5,6]。本文通过对1例5p15缺失综合征合并4q32重复综合征患儿的临床特点与分子遗传学分析，结合多种检测技术相互验证，明确病因，为临床诊断、预后评估及针对性遗传咨询提供有效依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料 患儿女孩，2020年2月首次到广东省妇幼保健院儿童遗传代谢与内分泌科门诊就诊，主诉为出生后发现体格发育和运动发育落后。首次就诊时年龄为1岁2个月，临床表现为不能独坐，不愿翻身，不能爬，无有意义发音，时具有特殊面容。门诊拟诊“生长发育迟滞，遗传代谢病？”。入院后对患儿进行相关检查。患儿女孩，G1P1，2018年10月出生，孕37周顺产。患儿出生体重2.15kg，体长45cm，出生时无窒息，Apgar评分10分，喂养正常。运动发育史：现仍不能独坐，不愿翻身，不能爬；语言发育史：无有意义发音，对外界刺激反应差。体格检查：营养不良貌，特殊面容表现，如小头畸形、满月脸、宽眼距、内眦赘皮、大鼻梁、招风耳、低耳位、双侧耳廓外侧可见肉赘(副耳)、小下颌、高额弓等(图1)；患儿哭声似猫叫。父母籍贯广东广州，非近亲婚配；否认家族遗传病史。

图1 患儿体格检查

1.2 辅助检查

1.2.1 常规检查 患儿入院后除了进行肝肾功能、心肌酶谱、电解质、血常规等检查外，还进行血糖、血氨、微量元素、血气分析、铁蛋白、血脂、甲状腺功能等代谢相关检查；同时进行了小儿心脏彩超检查以及遗传代谢病血串联质谱和尿液气相质谱检测。

1.2.2 全外显子组基因检测 本研究通过了广东省妇幼保健院医学伦理委员会审查批准，征得患儿父母的知情同意。抽取患儿静脉血5ml，采用Blood DNA Kit V2 CW2553血液提取试剂盒提取血液DNA，运用第二代基因测序技术进行分析。DNA全基因组文库的制备：利用KAPA Library Preparation Kit(Illumina © platforms): KR0453-v3.13取750ng DNA样本进行超声波打断，得到150-200 bp的DNA片段。将片段末端补平后用AMPure XP 纯化磁珠纯化，纯化后的DNA片段两端加A碱基(A-Tailing)并连接接头，连接后产物进行8个循环的PCR扩增。DNA样本捕获：在Agilent SureSelectXT2 Target Enrich System反应系统内对真空浓缩DNA文库样本进行杂交捕获。杂交混合液在65℃环境下孵育24h。而后加入DynabeadsMyOne Streptavidin T1(Invitrogen)。杂交捕获后的产物进行PCR扩增，13循环。PCR产物采用AgencourtAMPure XP 纯化磁珠进行纯化并用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行定量。高通量测序：取捕获后的DNA样本进行Illumina novaseq高通量测序。测序数据经Illumina Sequence Control Software(SCS)评估合格后，进行数据读取和生物信息学分析。

1.2.3 拷贝数变异测序(copy number variation sequencing，CNV-seq) 将 750 ng DNA样本进行超声打断，获得平均大小为200～300 bp的DNA片段，采用KAPA Library Preparation Kit试剂盒构建DNA文库。取构建好的DNA文库样本进行Illumina NovaSeq高通量测序。将高质量的双端测序reads利用Burrows-Wheeler Aligner工具比对到UCSC数据库的人类参考基因组序列。以50kb为预设窗口，每次调整量为5kb。每个窗口进行GC和人口模型两步校正，去除异常窗口后计算每个窗口的copy ratio跟参考集之间的标准差，标准差小于0.15则认为通过质控，然后用软件确定断裂点，得到最终的CNV区段大小和其copy ratio值。

2 结果

2.1 临床结果

2.1.1 常规检查结果 患儿常规生化检查和血液、尿液的串联质谱检查显示结果无明显异常，排除常见氨基酸、有机酸和脂肪酸代谢异常相关遗传代谢性疾病。

2.1.2 影像检查结果 彩色超声心动图检查提示：房间隔缺损。

2.2 全外显子组基因测序及CNV-seq 全外显子组基因测序提示：5p15.33p15.1(chr5:92294-16935982)×1，即5号染色体短臂大约16843kb的杂合缺失，及4q32.2q35.2(chr4:164246454-190948359)×3，即4号染色体长臂大约26701kb的重复。CNV-seq结果与全外显子组基因测序结果一致(图2)。上述拷贝数变异为致病性变异，且4q32.2q35.2重复在Decipher致病数据库中未见报道，而dbvar病例数据库中有与该区域相似重复片段的病例报道(病历号：nsv932361，区域：chr4:161678851-191012562×3，病例临床表型：发育迟缓和(或)其他重要的发育或形态学表型。父母DNA测序未发现相应变异，提示该变异为新生致病性变异。

图2 患儿全外显子组基因测序及CNV-seq结果

3 讨论

本研究中，我们应用全外显子组基因测序及CNV-seq发现：患儿存在5p15.33p15.1区域16843kb的杂合缺失(chr5:92294-16935982)，以及4q32.2q35.2区域26701kb的重复(chr4:164246454-190948359)。其中，5p15.33p15.1缺失区域包含了猫叫综合征的致病关键区域，即5p15.2(与猫叫综合征临床症状相关区域)及5p15.3(典型猫叫样哭声相关区域)，这其中约有包含hTERT基因在内的100多个基因位于关键区域内[7,8]。hTERT基因位于 5p15.33，主要编码端粒酶的催化亚基，是维持人体类端粒酶活性的必需成分；而端粒酶则在保持端粒稳定、基因组完整、细胞活性、造血干细胞和生殖细胞潜在增殖能力等方面有重要作用[9,10]。研究证实，猫叫综合征患者均存在hTERT等位基因的纯合缺失，而hTERT基因拷贝的杂合缺失，被认为是导致猫叫综合征的原因或者主要因素，是导致猫叫综合征表性改变的重要遗传因素[7]。另外，4q32.2q35.2区域拷贝数重复主要表现为生长发育迟缓和特殊面容。本例患者，具有猫叫综合征大部分典型临床表现，如：运动发育落后、语言发育落后、猫叫样哭声、体格检查异常包括小头畸形、满月脸、宽眼距、内眦赘皮、大鼻梁、招风耳、低耳位、小下颌、高额弓等；但某些临床表现并未发现，如耳聋、白内障、性腺发育不良等。综上考虑，患儿的异常临床表现，为5p15.33p15.1区域杂合缺失和4q32.2q35.2区域重复综合效应所致。该病例在国内尚属首次报道。

检测染色体病最常用的是细胞遗传学技术-染色体核型分析，它是诊断的“金标准”，能检测的染色体畸变主要包括染色体数目异常及大的染色体结构异常，其分辨率约为5Mb以上，这也是光学显微镜对染色体分辨率的极限。染色体核型分析技术的缺点也显而易见，那就是它对于缺失/重复范围小于5Mb的亚显微染色体结构异常无能为力，且对检测人员技术要求相对较高，需要长期培训，且受制于外周血细胞培养周期，报告等待时间相对较长(一般7～10d以上)。本研究则主要是应用分子遗传学技术-全外显子组基因测序及CNV-seq，进行染色体微缺失/微重复综合征检测。全外显子组基因测序联合CNV-seq是一种灵敏度极高的相对定量技术，自 2007年临床应用以来[11]，已广泛应用于染色体异常、基因位点变异、基因缺失重复变异等研究等领域。全外显子组基因测序联合CNV-seq弥补了经典细胞遗传学分析方法的不足，具有快速(24h内)、灵敏度高、特异性强等特点，已经成为常规的分子遗传检测学技术，在检测染色体小片段缺失和重复中发挥了重要作用[12,13]。本研究应用全外显子组基因测序联合CNV-seq的方法，为1例面容异常、发育迟缓的患者提供了快速准确的个体化诊断及出生后评估，有助于对其进行早期的康复及教育干预，具有临床应用价值。同时，我们的研究明确了患儿发病的遗传学病因，为患儿的精准治疗和后续该家庭的产前诊断和优生优育，打下了坚实的基础。