电子鼻结合OAV分析臭豆腐卤水的挥发性成分及风味活性物质

唐 辉，钟瑞敏，朱建华，李 跑，梁俊铭，蒋立文*

（1 韶关学院英东食品科学与工程学院 广东韶关512005 2 湖南农业大学食品科学技术学院 长沙410128）

臭豆腐有“东方奶酪”之称，是家喻户晓的传统美食，具有“闻起来臭，吃起来香”的独特风味。研究表明，臭豆腐中含丰富的蛋白质和氨基酸[1]，其中VB12含量较高，VB12对老年痴呆有良好的预防效果[2]。臭豆腐还是植物雌激素——雌马酚的良好食物来源[3-7]。长沙臭豆腐为半发酵型臭豆腐，是将豆腐坯浸入由豆豉、香菇、苋菜、竹笋和水等原料自然发酵而成的发酵卤水中一段时间，再油炸，拌佐料食用。臭豆腐卤水的风味成分对臭豆腐成品的风味至关重要。近年来，一些专家学者对臭豆腐卤水的挥发性风味物质进行研究。如：黄香华等[8]利用水蒸气蒸馏法结合气-质谱联用仪研究臭豆腐的主体气味物质；郑小芬等[9]研究了湖南本地的两种非发酵型臭豆腐卤水中的挥发性成分；刘玉平等[10]利用同时蒸馏萃取法和固相微萃取再结合气-质谱联用仪对北方老才臣臭豆腐中的挥发性成分进行提取分析。这些研究主要集中在臭豆腐卤水挥发性风味物质的定性方面，挥发性风味物质种类繁多，一些活性挥发性风味物质是影响食品风味的主要因素。关于臭豆腐卤水主要活性风味物质测定却鲜有研究报道。

电子鼻、顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱联用法 （Headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPMEGC-MS）是目前研究食品挥发性风味成分的常用方法。电子鼻是利用气体传感器阵列响应图案来识别气味的电子系统，能快速识别挥发性成分[11]，被广泛应用于食品[12-13]、农产品[14]、茶叶[15]、园艺产品[16]等方面，主要对研究对象的风味进行整体或真伪鉴别，然而不能确定这些风味物质的具体组成成分。将电子鼻和GC-MS 技术结合，既可以对风味进行宏观鉴别，又可以确定风味物质成分的种类和数量。如：陆宽等[17]采用电子鼻结合SPMEGC-MS 技术研究贵州5 种辣椒发酵后的挥发性成分，结果发现电子鼻能够很好地区分不同辣椒品种发酵后的风味，并通过GC-MS 法检出124 种挥发性风味物质。赵宁等[18]采用SPME-GC-MS 联用和电子鼻技术对3 种猕猴桃酒中香气物质进行分析，结果在3 种猕猴桃酒中检出63 种挥发性香气物质，同时，电子鼻亦可区分不同的猕猴桃酒，结果与GC-MS 测定结果基本一致。

香气活性值（Odor activity value，OAV），是指风味物质浓度与其气味阈值的比值[19]，可用来衡量风味物质对整体风味贡献的大小[20]。如：谢恬等[21]利用OAV 法分析五香驴肉风味活性物质，鉴定其中关键性风味活性物质主要为桉叶油醇、丁香酚、对丙烯基茴香醚、壬醛、2-甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪、2-乙酰基吡咯、麦芽酚等；蔡瑞康等[22]采用OAV 法对大黄鱼糟制过程中风味物质及风味活性物质进行分析，分别得出糟制0，1，12，16，30，35 d 大黄鱼的主体风味物质；孙洁雯等[23]利用OAV 法研究北方王致和臭豆腐的特征香气成分主要是吲哚、正丁醇、正丙醇、二甲基二硫、二甲基三硫、二甲基四硫等。为了解决长沙臭豆腐卤水主要活性风味物质尚未明确的问题，本文采用电子鼻对长沙臭豆腐卤水的主要挥发性成分进行分析，并结合HS-SPME-GC-MS 法检测其种类。采用内标法对卤水中各风味物质进行半定量分析，OAV 值分析关键风味活性物质，以期找到长沙臭豆腐卤水的特征风味物质，为臭豆腐卤水标准和工业化生产提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

臭豆腐卤水分别取自长沙创和食品有限公司的刚发酵成熟卤水（标记为Z1）和豆腐浸泡卤水（标记为Z2）；长沙聚美合豆制品有限公司的刚发酵成熟卤水（标记为J1）和豆腐浸泡卤水（标记为JP）。刚发酵成熟卤水是指以豆腐、豆豉、香菇、竹笋、芥菜或梅干菜等为原料经自然发酵3～6 个月，呈黑玫瑰状，臭味浓郁。豆腐浸泡卤水是指浸泡槽内用来浸泡豆腐的卤水，臭味较淡。

表1 电子鼻传感器与其响应物质Table 1 Electronic nose sensors and their response to odorant compounds

C7～C30正构烷烃混合物、邻二氯苯（色谱纯），美国Supelco 公司。

1.2 试验仪器与设备

GC-MS-QP2010 气相色谱-质谱联用仪，日本岛津；ISENSO SmartNose 电子鼻，上海瑞玢智能科技有限公司；CD-WAX 极性色谱柱、Talboys 数显型磁力加热搅拌器，上海安谱科学仪器有限公司；SPME 进样器、固相微萃取装置、15 mL 顶空采样瓶、85 μm Polyacrylate 萃取纤维，美国SUPELCO 公司；其它常规仪器设备由湖南农业大学食品科学技术学院和韶关学院实验室提供。

1.3 方法

1.3.1 电子鼻检测 样品准备：准确移取4 种卤水样品4 000 μL 置于电子鼻检测瓶中，迅速用专用瓶盖封口，垂直放置，静置5 min，待挥发性物质的气味充满样品瓶上空后进行电子鼻检测，每个样品平行测定3 次。

检测：试验前传感器清洗时间3 000 s，若传感器雷达图不够充盈，则重复清洗至完全充盈，顶空温度25 ℃，每次检测前传感器清洗200 s，电子鼻测定时间200 s，等待时间15 s，气体流量1 L/min。每个样品重复测定3 次。电子鼻传感器性能描述见表1。

1.3.2 HS-SPME-GC-MS 检测 HS-SPME 条件：纤维萃取在首次使用时，按照厂家推荐的条件进行老化。分别移取2.0 mL 的4 种臭豆腐卤水于顶空瓶中，并添加5 μL 内标稀释液（取15 μL 邻二氯苯定容于250 mL 棕色瓶中），再分别进行萃取，萃取条件根据作者已发表的论文[24]，采用85 μm Polyacrylate 白色萃取纤维，萃取温度60 ℃，平衡时间20 min，萃取时间40 min 进行萃取。将已萃取的萃取纤维插入气相色谱进样口，在240 ℃下解析5 min。

GC 条件：色谱柱为CD-WAX 弹性石英毛细管柱 （30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气为氦气（99.999%），流速为1.0 mL/min；进样口温度为240 ℃；不分流进样。升温程序为：柱温50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 升温至200 ℃，保持14 min，以15 ℃/min 升温至240 ℃。

MS 条件：离子源为电子电离（electron ionization，EI）源，离子源温度200 ℃；电子能量70 eV；发射电流150 μA；倍增器电压1 037 V；接口温度220 ℃；质量扫描范围45～500 m/z。

1.3.3 数据分析

1.3.3.1 GC-MS 定性分析 总离子流色谱图经美国国家标准技术研究所NIST2014s 标准谱库检索定性鉴定出成分，并结合计算保留指数共同确定化合物。

保留指数按式（1）计算：

式中，I——保留指数；n——碳数；ti——待测挥发性成分的保留时间，min；tn——具有n 个碳原子的正构烷烃的保留时间，min；tn+1——具有n+1个碳原子的正构烷烃的保留时间，min。

1.3.3.2 GC-MS 定量分析 采用内标法定量。内标法定量计算公式如下：

式中，C1——待检化合物的质量浓度，μg/mL；C0——加入的内标化合物 （邻二氯苯）的质量浓度，μg/mL；A1——待检化合物的峰面积；A0——加入的内标化合物的峰面积；V1——每次萃取卤水样品的体积，2.0 或5.0 mL；V0——加入的内标化合物（邻二氯苯）的体积，5 或10 μL。

1.3.3.3 相对香气活性值（ROAV）计算

式中，Ci——某挥发性风味物质的质量浓度，μg/mL；OTi——某挥发性风味物质的气味阈值，μg/mL。

OAV 可用来衡量风味物质对整体风味贡献的大小，当OAV≥1 时，则认为该风味物质是关键的风味化合物，对其风味具有重要的贡献作用，且OAV 越大，对整体风味的贡献度就越大；当0.1≤OAV＜1 时，则认为该风味物质对样品的风味也具有一定的贡献作用。

1.3.3.4 利用SPSS 19.0 对电子鼻的气味特征值进行综合主成分评价[25]

综合主成分评价模型：

式中，a1i，a2i，……，api（i=1，……，m）为X 的协方差阵Σ的特征值对应的特征向量；ZX1，ZX2，……，ZXp是原始变量经过标准化处理的值（本文指的数据标准化是指Z 标准化）。

以电子鼻检测所得气味特征值为指标，分析4 个卤水样品，可得出电子鼻传感器的敏感性综合主成分评价模型：

将4 个卤水的气味特征值代入式（4），并对其按综合主成分得分值进行排序，即可对14 个传感器的敏感性进行综合评价。

1.3.4 数据处理软件 利用电子鼻自带的 Win Muster 软件进行PCA 分析；用Oringin 软件进行雷达图对比分析。

2 结果与分析

2.1 电子鼻测定结果与分析

2.1.1 电子鼻PCA 分析结果 由图1可知，DI值=85.9%>80%，说明本试验中电子鼻能有效区分4 种卤水样品的气味；第一主成分PC1 贡献率达到82.5%，第二主成分PC2 贡献率达到14.6%，PC1 和PC2 贡献率之和达到97.1%，说明数据涵盖了卤水样品的绝大部分气味信息。进一步分析比较发现，刚发酵成熟卤水Z1 和J1 在主成分1上距离较近，豆腐浸泡卤水Z2 与JP 在主成分2上距离较近，由此看出刚发酵成熟卤水与豆腐浸泡卤水的风味成分在主成分1 和2 上都相差较大，而刚发酵成熟的卤水Z1 和J1 在某些风味成分上相似。

2.1.2 雷达图分析 由图2可知，电子鼻中S1、S5、S7、S8、S9、S10、S12 等传感器对4 种卤水均有明显的响应，且响应值均不相同，响应值较为明显的传感器分别是S1、S7、S8，为了进一步分析不同的传感器的贡献，接下来利用SPSS 软件对电子鼻的传感器进行主成分综合模型分析。

图1 臭豆腐卤水样品的PCA 图Fig.1 Principal component analysis of samples of stinky tofu brine

图2 臭豆腐卤水样品的电子鼻雷达图Fig.2 Electronic nose radar profiles of samples of stinky tofu brine

2.1.3 电子鼻14 个传感器的综合主成分评价结果 由表2可知，综合主成分评价结果与雷达图分析结果一致，最敏感的传感器排序由高到低为S1、S8、S7 等，这3 个传感器分别对芳香族类化合物、氨类、脂肪烃含氧衍生物类化合物敏感，说明这4 种样品的挥发性气味物质有较高的芳香族类化合物、氨类、脂肪烃含氧衍生物类等化合物。为明确各卤水样品风味成分的组成和含量，采用GC-MS 对4 种卤水的挥发性风味物质进行定性、定量分析。

2.2 GC-MS 与OAV 结果与分析

由表3可知，从两家公司采取的刚发酵成熟的卤水和豆腐浸泡卤水4 个样品中共鉴定出25种挥发性成分，其中，刚发酵成熟卤水Z1 和J1 中分别检出22，15 种挥发性风味物质，含量为688.616，58.927 μg/mL。Z1 主要以9 种酸类脂肪烃含氧衍生物 （57.95 μg/mL）、4 种苯酚类芳香族（261.30 μg/mL）、2 种吲哚类芳香族 （336.65 μg/mL）和2 种含硫化合物类（26.49 μg/mL）等化合物为主。J1 主要以6 种酸类脂肪烃含氧衍生物（18.23 μg/mL）、5 种苯酚类芳香族（31.94 μg/mL）、2 种吲哚类芳香族（6.92 μg/mL）物质为主。豆腐浸泡卤水Z2 和JP 中分别检出3、6 种挥发性风味物质，含量为5.75，0.65 μg/mL，两种卤水中主要是苯酚类和吲哚类等芳香族物质，Z2 中有2 种苯酚类物质（4.64 μg/mL），1 种吲哚类物质（1.11 μg/mL）。JP 中有4 种苯酚类物质（0.31 μg/mL），1 种吲哚类物质（0.28 μg/mL）。由此可知，4 种卤水中主要的挥发性成分种类与电子鼻分析结果一致，具体含量为Z1>J1>Z2>JP，且刚发酵成熟卤水中的挥发性成分种类和含量远高于豆腐浸泡卤水，这正是刚发酵成熟的卤水臭味浓郁，豆腐浸泡卤水臭味较淡的原因。4 种卤水中，共有的主要是苯酚类和吲哚类物质，因而使得各种卤水又呈现相似的特殊气味。

表2 电子鼻传感器综合主成分得分值Table 2 Synthetic principal component of electronic nose sensors

臭述描味气味味气心味花瑰香味酸性激刺的臭、汗味油、黄味酪奶和味酪奶和味臭酸的快臭物、动味精菜玫木酸烈臭臭臭臭愉臭臭酒烂-淡柏醋强腐腐腐汗不汗酸述描征特味风与、OAV量含质物味风性发挥水卤种4 3表，odor activity values and flavor characteristics of volatile compounds in four stink tofu brines Contents Table 3 JP J1 Z2 Z1味气OAV 值/量·-1含μg mL OAV 值量 ·/μg -1 mL含OAV 值/量·-1含μg mL OAV 值/量·-1含μg mL/-1值阈μg·mL CAS 号b RI a RI-0.03-1.86-N-4.63 N N 0.0023 0.23 N N N N 100.00 64-17-5 934～937 N N N N N N N 56.42 3.78-2 6.70×10 74-93-1 696 N N N N N N N-0.58-698-87-3 1 779 1 794.715 N N N N N N 0.26 0.27 1.10 60-12-8 1 879.616 1 875～1 899-0.03-1.63 N N-N-77-53-2 2 097 2 094.943-N-18.23-N-57.95 N N 0.41 2.45 N N 1.01 6.08 6.00 64-19-7 1 428.778 1 424～1 446 N N 0.09 1.78 N N 0.28 5.67 20.00 79-09-4 1 513.317 1 490～1 525 N N 0.29 2.37 N N 0.96 7.79 8.10 79-31-2 1 543.548 1 524～1 561 N N 25.75 6.18 N N 66.54 15.97 0.24 107-92-6 1 601.333 1 593～1 607 N N 7.53 5.27 N N 27.19 19.03 0.70 503-74-2 1 643 1 644.387 N N 0.06 0.18 N N 0.54 1.62 3.00 109-52-4 1 710.524 1 698～1 730 N N N N N N 3.44 0.55 0.16 646-07-1 1 777.585 1 774～1 809 N N N N N N 0.28 0.84 3.00 142-62-1 1 812 1 819.775 N N N N N N 1.00 0.40 0.40 4536-23-6-1 844.096称名文中质物物生衍氧醇乙醇硫甲醇丙-2-基苯1-醇乙苯脑木柏酸乙酸丙酸丁异酸丁酸丁基甲3-酸戊正酸戊基甲4-酸己酸己基甲2-号序含烃肪脂类、醇1①②③④⑤类、酸2①②③④⑤⑥⑦⑧⑨

述描味气味气性激味汁、墨水皮、焦臭革、皮臭泥臭物、动臭水苏、来臭厩马味酚基烷有臭物动与便臭、恶臭便味球生、卫味丸脑、橡臭卜萝、煮臭水臭、臭菜蔬烂、腐臭气味风卜萝、咸臭蒜JP/量含OAV 值·μg-1 mL-N刺N N-0.31 0.01 胶0.05窖0.55 0.03臭牛0.13 0.08--0.15稍-N-0.28粪N N粪50.00 0.28樟N N-N胶N N胶煤N N洋-0.62 J1 OAV 值N N-0.13 431.09 1.04---2.93 1 162.50 N-N N-量 ·/μg -1 mL含N N 31.94 0.77 23.71 0.64 6.58 0.24 6.92 0.41 6.51 N N N N 58.95 Z2/量含OAV 值·μg-1 mL-N N N-4.64 0.49 2.89 31.82 1.75 N N N N N N-1.11 7.93 1.11 N N N N-N N N N N-5.75）3表（续Z1味气OAV 值/量·-1含μg mL/-1值阈·mL μg号CAS b RI a RI称名文中质物号序-1.47类、酮3-1.47-551-93-9 2 187 2 173.583酮乙苯基氨邻①物合化类族香芳-261.30类酚、苯1 17.16 101.23 5.90 108-95-2 1 965.379 1 950～1 989酚苯①-2 123.69 2 248.91 5.50×10 106-44-5 2 050 2 040.609酚苯基甲4-②49.25 30.39 0.62 123-07-9 2 137.326 2 167～2 175酚苯基乙4-③-5.99-645-56-7 2 234 2 227.409酚苯基丙4-④-N-96-76-4 2 270 2 290.975酚苯基丁叔二，4-2⑤-336.65类哚、吲2 755 105.70 0.14 120-72-9 2 412 2 387.374哚吲①4-3 230.95 4.12×10 5.60×10 83-34-1 2 459 2 432.541哚吲基甲3-②它、其3 2.67 0.16 0.06 91-20-3 1 707 1 703.872萘①-26.49物合化硫含1 350.83 16.21-2 1.20×10 624-92-0 1 066 1 065.637硫二基甲二①6 1.03×10 10.28-5 3658-80-8 1.00×10 1 366 1 350.094硫三基甲二②-688.65-计总。得所库据数NIST阅b 查；RI得所算）计（1式公a 按；RI算计法无或献文考参关相到阅查：未；-出测检：未：N注

分析Z1、J1、Z2 和JP 卤水的苯酚类物质，发现苯酚和4-甲基苯酚均存在于4 种卤水中，苯酚的含量分别是101.23，0.77，2.89，0.05 μg/mL，4-甲基苯酚的含量分别是123.69，23.71，1.75，0.03 μg/mL。苯酚有较浓郁的胶水、墨汁味[23]。4-甲基苯酚呈现窖泥和皮革臭[26]。在前期研究中发现南方臭豆腐卤水中存在苯酚与4-甲基苯酚物质，这可能与其使用的原材料和微生物对氨基酸的分解作用有关[24]。结合OAV 值看出，4-甲基苯酚在Z1、J1、Z2 卤水中的值远大于1，表明4-甲基苯酚是这3种卤水的风味活性物质，JP 中风味物质总体含量较少，但4-甲基苯酚的OAV 值仍有0.55，说明4-甲基苯酚对JP 的风味有非常重要的影响。苯酚在Z1 中的OAV 值远大于1，但在J1、Z2、JP 中的值均小于1，这与苯酚的高阈值有一定关系，同时也说明苯酚对卤水的风味有一定影响。4-乙基苯酚呈牛马厩臭、来苏水臭[27]，在Z1、J1 和JP 中，含量分别是30.39，0.64，0.08 μg/mL，在Z1、J1 中 的OAV 值都大于1，在JP 中为0.1≤OAV＜1，说明4-乙基苯酚对这3 种卤水风味有较大的影响。

分析4 种卤水的吲哚类物质，发现吲哚存在于Z1、J1、Z2 等3 种卤水中，含量分别为105.70，0.41，1.11 μg/mL，3-甲基吲哚存在于Z1、J1、JP 等3 种卤水中，含量分别为230.95，6.51，0.28 μg/mL。吲哚与3-甲基吲哚都是亚胺类物质，可能是卤水中某些细菌对蛋白质、氨基酸的降解产物[28]，它们都具有粪便臭、动物臭等恶臭[23-24]，因其较低的阈值，使其在各种卤水的OAV 值远高于1，为这几种卤水的风味活性物质。

4 种卤水中发现仅刚发酵成熟卤水Z1 和J1中有酸类物质，主要是乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、3-甲基丁酸和正戊酸等挥发性酸。结合OAV 值分析，丁酸、3-甲基丁酸在两种卤水中的OAV 值都大于1，表明这两种挥发性酸是刚发酵成熟卤水的风味活性物质。丁酸、3-甲基丁酸都具有刺激性酸味和腐臭味等[27]，是由厌氧微生物发酵难消化的碳水化合物而产生[29]。豆腐浸泡卤水Z2 和JP中未见酸类物质，具体原因未见报道，还需进一步研究。

另外，4 种卤水中仅Z1 中有二甲基二硫、二甲基三硫和甲硫醇，含量分别为16.21，10.28，3.78 μg/mL。二甲基二硫、二甲基三硫是含硫氨基酸降解产物，两者具有橡胶臭、煤气臭、腐烂蔬菜臭、洋蒜臭、咸萝卜风味等[23]。甲硫醇具有烂菜心气味[30]。因3 种物质的阈值极低，在Z1 中的OAV 值远远大于1，因此说明这3 种物质是该卤水主要的风味活性物质，这或许就是Z1 较其它卤水风味更为浓郁的原因。

3 结果与讨论

利用电子鼻技术对刚发酵成熟卤水Z1、J1 和豆腐浸泡卤水Z2、JP 的挥发性成分及活性风味物质进行分析，结果表明，电子鼻能够较好地区分4个卤水样品的风味，主成分分析显示4 个样品间差异明显，雷达图和主成分综合模型表明贡献较高的传感器是S1、S8、S7，这3 个传感器主要对芳香族类化合物、氨类、脂肪烃含氧衍生物类等物质较敏感。

为进一步明确各卤水样品风味成分的组成和含量，采用HS-SPME-GC-MS 法，结合OAV 值对4 个卤水样品进行了检测和分析，结果表明，Z1、J1、Z2 和JP 样品中共鉴定出25 种挥发性成分，种类分别为22，15，3 和6 种，含量分别为688.616，58.927，5.75，0.65 μg/mL。Z1 主要以9 种酸类脂肪烃含氧衍生物 （57.95 μg/mL）、4 种苯酚类芳香族（261.30 μg/mL）、2 种吲哚类芳香族 （336.65 μg/mL）和2 种含硫化合物类（26.49 μg/mL）等化合物为主。J1 主要以6 种酸类脂肪烃含氧衍生物（18.23 μg/mL）、5 种苯酚类芳香族（31.94 μg/mL）、2 种吲哚类芳香族（6.92 μg/mL）物质为主。Z2 中有2 种苯酚类物质（4.64 μg/mL），1 种吲哚类物质（1.11 μg/mL）。JP 中有4 种苯酚类物质（0.31 μg/mL），1 种吲哚类物质（0.28 μg/mL）。通过OAV 分析，4 种卤水中有一些共有的活性风味活性物质，如苯酚、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚、吲哚、3-甲基吲哚等芳香族化合物。刚发酵成熟卤水Z1 和J1 中还有丁酸、3-甲基丁酸等脂肪烃含氧衍生物是这两种卤水的风味活性物质。除此之外，风味浓郁的Z1 中还有二甲基三硫、二甲基二硫和甲硫醇等风味活性物质，此结果与电子鼻结果基本一致。