盐预处理对大麦种子萌发和小孢子愈伤形成的影响

徐红卫，郭桂梅，高润红，何婷，杜志钊，李静，陈志伟，陆瑞菊，王亦菲，刘成洪

1.上海市农业科学院生物技术研究所/上海市农业遗传育种重点实验室，上海 201106； 2.扬州大学农学院，扬州225009； 3.上海市农业科技服务中心，上海 200335

盐胁迫已经成为制约我国农作物生长与产量的重要因素之一[1]。在作物发育的关键时期对种子、幼苗或者细胞进行化学物质预处理，是改善作物耐盐性的有效措施[2-3]。大麦(HordeumvulgurL.)在禾谷类作物中耐盐性较强，是开拓盐荒的先锋作物[4]，但是品种之间的耐盐性差异很大，深入研究耐盐性差异的品种在关键生育期对盐预处理的响应机制，对于品种的耐盐性评价有重要的指导意义[5]。

种子萌发期为研究品种响应盐胁迫机制的关键时期，该阶段对植株能否存活和进一步生长发育至关重要[6]。已有研究报道，一定浓度的NaCl预处理可提高盐敏感种子萌发阶段的耐盐性[7-9]，发芽率和主根长为该时期区分不同品种耐盐性的重要指标[10]。相比种子，小孢子时期是植物胚胎发育过程中重要的阶段[11]，可作为更加理想的胁迫对象。孙月芳等[12]利用NaCl溶液处理大麦小孢子，发现小孢子对外界胁迫刺激极为敏感，存活率明显受到影响。通过小孢子离体盐胁迫培养技术，不仅提高了耐盐材料的筛选效率，而且结合田间鉴定，可快速筛选获得稳定遗传的耐盐纯合株系[13]。Liu等[13]对大麦小孢子时期响应盐胁迫的关键基因也进行了研究，发现在连续的盐胁迫下，细胞防御系统为调控基础蛋白质合成产生了翻译抑制，HveIF1A(翻译起始因子1)和HvRPLP0基因(核糖体蛋白)等下调表达，同时一系列热休克蛋白基因HvsHSP1和E3泛素连接酶基因HvSIAH1E3等被选择性地激活，这些基因对小孢子诱导胚性愈伤组织缓解盐胁迫起着重要作用。前期研究者已证实大麦小孢子培养时期与植株生长发育时期对盐胁迫的响应具有相关性[14]，但是关于盐预处理对大麦种子萌发和小孢子愈伤形成的影响效应尚未明确。

本研究以耐盐性存在差异的2个大麦品种花11和花30为研究对象，探究盐预处理对品种间种子萌发过程的影响效应在小孢子培养过程中的表现，同时在小孢子时期对2个品种响应盐胁迫关键基因的表达进行研究，旨在为应用小孢子技术鉴定大麦种质资源的耐盐性提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大麦耐盐品种花11和盐敏感品种花30，均由上海市农业科学院植物细胞工程研究室、上海市农业遗传重点实验室提供。

1.2 种子萌发期耐盐性鉴定方法

首先将直径为9 cm的培养皿清水洗净后灭菌并烘干，放入2张滤纸待用。其次，选择饱满整齐的健康种子，利用3% H2O2消毒8 min后，蒸馏水连续冲洗3次，于30 ℃浸泡于0、5和15 g/L的NaCl溶液，保湿过夜，待种子露白后均匀排放于培养皿的滤纸上，再次加入0、5、10和15 g/L的NaCl溶液处理，并将所有种子置于25 ℃恒温光照培养箱中发芽。6 d后统计种子的发芽率和主根长度。每个处理共设置3次重复。

1.3 小孢子培养方法

小孢子的游离及培养方法主要参考文献[15]。选取发育处于单核早中期的大麦穗，先将其置于5 ℃冰箱中预处理17 d，再用饱和漂白粉溶液消毒大麦穗15 min。于每个试管中分别接种10个穗，加入15 mL无菌提取液(60 g/L的甘露醇中添加0.976 g/L 的N-吗啡乙烷磺酸和1.1 g/L的CaCl2)。利用高速分散器超速旋切，106 μm筛网进行过滤，滤液以700 r/min低速离心5 min，共重复3次，最后收集小孢子。小孢子培养时先将其置于25 ℃黑暗的无菌盐预处理液中，NaCl溶液质量浓度分别为0、100和300 mg/L，2 d后，将小孢子用无菌提取液和培养基分别洗涤1次，将小孢子密度调节至1.1×105/mL，然后取1 mL小孢子悬浮液于培养皿(20 mm×15 mm)中，Parafilm封口后，置于25 ℃培养箱暗培养。培养至28 d时，称取愈伤组织的质量并取材、液氮速冻，-80 ℃ 保存。其中，诱导培养基以改良的N6培养基为基本培养基，同时分别添加1.0 mg/L 2,4-D、0.5 mg/L KT、90 g/L麦芽糖和0、100、200和300mg/L的NaCl溶液。每个实验共设置4次重复。

1.4 荧光定量PCR检测

将样品愈伤组织的RNA通过Trizol Reagent (Invitrogen)提取后，再利用SuperScriptTMⅢ反转录酶(Invitrogen)获得样品的cDNA[16]。引物序列由北京六合华大基因科技有限公司合成，其中，盐响应基因的引物序列参考文献[13]，HvActin和HvGAPDH内参基因的引物序列参考文献[16]，详见表1。采用7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystem)对大麦小孢子时期响应盐胁迫的4个关键基因的相对表达量进行分析。定量PCR的总反应体系为20 μL，包括样品cDNA (约50 ng/μL) 4 μL，正反向引物(10 μmol/L)各2 μL，2×power-up SYBR qPCR Mix (Toyobo) 10 μL和ddH2O 2 μL，反应程序为:95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸1 min，40个循环[16]。

表1 荧光定量PCR引物Table 1 Primers for quantitative real-time PCR

1.5 统计分析

发芽率、主根长和愈伤产量测定结果利用SPSS21.0软件的Duncan’s新复极差法进行差异显著性分析；定量PCR的数据根据Chen等[17]的方法计算其基因相对表达量，LinReg软件分析相关基因引物的扩增效率。

2个品种间愈伤产量的相对比值=同一处理下花30的愈伤产量/花11的愈伤产量；

2个品种间发芽率的相对比值=同一处理下花30的发芽率/花11的发芽率；

2个品种间主根长的相对比值=同一处理下花30的主根长/花11的主根长。

2 结果与分析

2.1 2个大麦品种在种子萌发期对盐预处理的响应

为了明确2个大麦品种在种子萌发期对盐预处理的响应差异，以发芽率和主根长作为鉴定指标。在没有用NaCl预处理种子的情况下，比较2个大麦品种对不同质量浓度盐胁迫的直接反应(图1A、D)，结果显示：在正常萌发条件下，2个大麦品种都能正常发芽，且发芽率无显著差异，随着培养基中NaCl质量浓度的提高，花30的发芽率显著低于花11(图1A)。在正常萌发条件下，花30的主根长度显著大于花11；但在盐胁迫条件下，花30的主根长度与花11无显著差异，表明花30主根长的抑制程度显著高于花11(图1D)。说明，花30在种子萌发期对盐胁迫的直接耐受性低于花11。种子经过5 g/L NaCl预处理后，在0 g/L盐胁迫下，花30的发芽率只有30%，而花11的发芽率为66.67%，花30的发芽率相对于花11显著减少了55%，在5 g/L和10 g/L盐胁迫下，花11分别具有40%和16.67%的发芽率，花30则完全不能萌发(图1B)；在5 g/L NaCl预处理后，花30的主根长度也显著小于花11，在0 g/L盐胁迫下，花30的主根长相对于花11显著减少了26.96% (图1E)；当种子经过15 g/L NaCl预处理时，花30在0和5 g/L盐胁迫下的萌发率分别为50%和43.33%，发芽率与花11无显著差异(图1C)，主根长度也是如此(图1F)；在10 g/L盐胁迫下，花30的发芽率和主根长显著优于花11，分别提高了41.75%和32%(图1C、F)。说明，花30经过低质量浓度NaCl预处理后，对盐胁迫的耐受性也低于花11，但是经过高质量浓度(15 g/L)NaCl预处理后，对10 g/L盐胁迫的耐受性增强，显著优于花11。

A-C:不同质量浓度的NaCl预处理条件下，2个品种在不同质量浓度NaCl胁迫下的发芽率。其中，A:0 g/L NaCl预处理; B:5 g/L NaCl预处理; C:15 g/L NaCl预处理; D-F：不同质量浓度的NaCl预处理条件下，2个品种在不同质量浓度NaCl胁迫下的主根长。其中，D:0 g/L NaCl预处理; E:5 g/L NaCl预处理; F:15 g/L NaCl预处理。每一柱状图上不同字母代表同一性状在2个品种不同处理间的差异。A-C:The germination rate of the two materials cultured at different salt concentrations with 0 g/L (A),5 g/L (B) and 15 g/L (C) NaCl pretreatment; D-F:The taproot length of the two materials cultured at different salt concentrations with 0 g/L (D),5 g/L (E) and 15 g/L (F) NaCl pretreatment.Different letters on the histogram indicate the significant differences of a trait among different treatments between two cultivars.图1 2个大麦品种在种子萌发期对盐胁迫的响应Fig.1 Response of the two barley cultivars to salt stress during the seed germination stage

2.2 2个大麦品种在小孢子培养时期对盐预处理的响应

为了探索2个大麦品种在小孢子时期对盐预处理的响应差异，我们对小孢子培养后的愈伤产量进行比较，以愈伤组织产量的高低作为耐盐性高低的评判指标。在无NaCl预处理的条件下，花30的小孢子在不同质量浓度NaCl培养基上获得的愈伤产量均小于130 mg/皿,而花11的愈伤产量均大于180 mg/皿，花30的愈伤产量显著低于花11，表明花30在小孢子时期对盐的直接耐受性低于花11(图2A)。经过100 mg/L NaCl预处理后，花30的小孢子在0、100、200和300 mg/L NaCl培养下获得的愈伤产量均显著低于花11，表明低质量浓度的NaCl预处理对花30的小孢子造成的损伤很大(图2-B)；经过300 mg/L NaCl预处理后，花30 的小孢子在不同质量浓度NaCl处理下培养获得的愈伤产量明显高于低质量浓度(100 mg/L)NaCl预处理的小孢子，且2个品种的愈伤产量在0、100和200 mg/L NaCl的培养基上均无显著性差异，但在300 mg/L NaCl的培养基上，花30的愈伤产量显著超过花11的21.64%(图2C)，表明，花30小孢子受高质量浓度的NaCl(300 mg/L)预处理诱导后，对高质量浓度的盐胁迫耐受性增强。

A:0 mg/L NaCl预处理下，2个品种在不同质量浓度盐胁迫培养下的愈伤产量； B:100 mg/L NaCl预处理下，2个品种在不同质量浓度盐胁迫培养下的愈伤产量； C:300 mg/L NaCl预处理下，2个品种在不同质量浓度盐胁迫培养下的愈伤产量。A:Calli yield of the two materials under salt stress with 0 mg/L NaCl pretreatment; B:Calli yield of the two materials under salt stress with 100 mg/L NaCl pretreatment; C:Calli yield of the two materials under salt stress with 300 mg/L NaCl pretreatment.图2 预处理和培养基中NaCl质量浓度对花11和花30愈伤产量的影响Fig.2 Effect of NaCl concentration in pretreatment and medium on calli yield of H11 and H30

2.3 2个大麦品种在2个时期盐胁迫下生长指标的相关性分析

通过比较2个供试材料在种子萌发阶段与小孢子诱导愈伤阶段的发芽率、主根长和愈伤产量的相对比值发现，愈伤产量和发芽率、主根长之间显著正相关，相关系数分别是0.600和0.648(表2)。

表2 2个大麦品种种子萌发期和小孢子诱导愈伤期相对生长比值的Pearson相关性分析Table 2 Correlation analysis of the relative differences values of germination rate,taproot length and calli yield between two cultivars

2.4 2个大麦品种在小孢子时期响应盐胁迫的关键基因的表达模式

为进一步分析2个品种在小孢子时期响应盐预处理的分子机制，研究了小热激蛋白基因HvsHSP1、E3泛素连接酶基因HvSIAH1，核糖体保护蛋白基因HvRPLPO和翻译起始因子1基因HveIF1A在2个品种中于0和300 mg/L NaCl溶液培养下的表达模式(图3)。在无NaCl预处理时，2个品种在正常条件和盐胁迫处理下的HvsHSP1基因表达量均无显著性差异，但是经过300 mg/L NaCl预处理后，相比0 mg/L培养基，在300 mg/L NaCl培养基下，花11中该基因的表达量显著减少了97.09%，花30中基因表达量却显著增加93.95% (图3A)；在0 mg/L和300 mg/L NaCl预处理条件下，2个材料之间的HvSIAH1基因表达量在不同NaCl胁迫培养基上均无显著性差异(图3B)；HvRPLPO基因在无预处理条件下，于300 mg/L NaCl培养时，花30中基因表达量较花11显著增加，经过NaCl预处理后，在300 mg/L NaCl培养条件下，该基因在花30的表达量与花11无显著性差异(图3C)；HveIF1A基因在无NaCl预处理的条件下，相比0 mg/L培养条件，花30中基因表达量在300 mg/L NaCl胁迫时显著减少了49.71%，但是在300 mg/L NaCl预处理的条件下，花30中基因表达量较0 mg/L培养条件显著增加了77.11%，较花11在同样处理下显著增加了59.15%(图3D)。结果表明，经过高质量浓度NaCl预处理后，HvsHSP1和HveIF1A基因可能对于花30缓解高浓度的盐胁迫起着重要作用。

A: HvsHSP1; B:HvSIAH1; C:HvRPLPO; D:HveIF1A.图3 2个品种在小孢子时期响应盐胁迫的关键基因的表达模式Fig.3 Expression of the key genes associated with salt tolerance at the microspore culture stage between the two cultivars

3 讨 论

植物对逆境的适应与抵抗有多种形式，其中对关键发育时期的种子、幼苗或者细胞通过预处理的方式获得抗逆性是一种最普遍而有效的方式[8]。有研究表明，作物在生长发育的关键时期对盐胁迫预处理的响应是作物应对盐胁迫的关键[6，18]。种子萌发和幼苗建成是植株水平生长发育的关键时期，该阶段的耐盐性可以反映植株水平的耐盐性[14]，而小孢子是减数分裂后四分体释放出的单核细胞，小孢子时期是高等植物生活史中雄配子体发育过程中重要的阶段。有研究表明，在大麦、番茄、苜蓿和大豆等植物中，细胞水平的耐盐性与植株水平耐盐性是一致的[19]。本研究结果表明，大麦小孢子诱导愈伤阶段与种子萌发阶段2个发育时期对NaCl预处理的响应具有显著的正相关性，花30在直接盐胁迫或低质量浓度NaCl诱导处理后的耐盐性低于花11，但是经过高质量浓度(萌发期为15 g/L NaCl，小孢子时期为300 mg/L)NaCl预处理后，花30种子和小孢子的耐盐性显著增加，尤其在高质量浓度的盐胁迫培养时，发芽率、主根长和愈伤产量均显著优于花11。据此推测，作物品种内在的遗传基础决定了不同品种在小孢子诱导愈伤阶段或种子萌发阶段等关键发育时期对NaCl引发或预处理后的响应差异。因此，在小孢子离体培养早期或种子萌发阶段实施NaCl盐胁迫预处理，对于品种的耐盐性评价具有重要意义。

近年来随着对植物耐盐分子机制研究的不断深入，发现编码小热激蛋白的基因在植物逆境胁迫响应等过程中发挥重要功能[20]。Zhao等[21]的研究表明LeHSP21.5基因在番茄中过量表达，转基因植株对盐的耐受性显著增强。Ruibal等[22]报道了在苔藓中过量表达PpHSP16.4基因能增强植株的耐盐性。本研究中，经过300 mg/L NaCl预处理后，在盐胁迫的培养基上，盐敏感品种中HvsHSP1基因的表达量也显著增强。该结果与Liu等[13]的研究结果相似，说明，热休克蛋白作为分子伴侣，参与蛋白质折叠、装配、易位和退化，它的激活可能对于盐敏感品种缓解由于盐胁迫引起的内质网应激以及维持组织细胞的自稳和环境适应性方面起着重要作用。植物的耐盐性状为数量性状，受多基因控制，涉及到多种耐盐生理生化机制和诸多基因的选择性差异表达，仅通过对单一的功能基因进行遗传改良来提高植物的耐盐性具有非常大的局限性。因此，对基因表达的调控研究十分重要。真核翻译起始因子1A(eIF1A)是植物中重要的蛋白合成调控因子之一，超表达该基因可明显增强植物的抗逆性，被认为是盐胁迫耐受的一个重要决定因素[23]。Liu等[13]也发现转录起始因子eIF1A在小孢子细胞应答盐胁迫中发挥作用。本研究中，HveIF1A基因在无NaCl预处理的条件下，花30中基因表达量在盐胁迫时显著减少，但是在300 mg/L预处理的条件下，花30中基因表达量在盐胁迫时显著增加，说明盐胁迫下，花30的翻译起始受到盐胁迫的抑制，但是经过NaCl预处理后，翻译起始能力增强。

本研究揭示不同大麦品种在小孢子盐胁迫培养过程中对前期盐预处理的响应能力存在差异，与种子萌发过程对盐预处理响应能力的差异在某种程度上存在一致性，且发现小孢子经过高质量浓度NaCl预处理后，后期诱导愈伤中HveIF1A和HvsHSP1在受到盐胁迫时会诱导上调表达，可能与其耐盐性增强有关，可为进一步利用小孢子培养体系鉴定品种的耐盐性以及耐盐性状遗传改良提供参考。