小麦4B染色体上LOX基因的等位变异及其区域分布

王黎明 孔维玮 高华利 ，3 董普辉 闫雪芳 王春平 王洪刚 李兴锋

（1河南科技大学农学院，471003，河南洛阳；2山东农业大学农学院/作物生物学国家重点实验室，271018，山东泰安；3河南省黄泛区农场，466000，河南周口）

脂肪氧化酶（LOX）是一种在自然界中广泛存在的含非血红素铁的双加氧酶，能够催化含有顺-顺-1，4-戊二烯结构的多聚不饱和脂肪酸加氧反应和生成具有共轭双键的过氧化合物的酶蛋白，属于多聚不饱和脂类的酶系家族[1-4]。目前，小麦LOX基因家族中共鉴定到至少50个成员，可分为9-LOX和13-LOX两个亚家族，在50个TaLOX基因中有40个都是复制产生的，而TaLOX基因并非随机分布，他们被分别定位在19条小麦染色体上[5]。LOX是一种存在于小麦籽粒中含量很低的酶蛋白，是茉莉酸生物合成途径中的关键酶之一[6-7]，对小麦加工品质和色泽起着重要作用[8-10]，LOX也是影响小麦面粉及其制品的口感、营养价值以及其能否吸引消费者的重要指标[11-14]。Leenhardt等[11]和Irvine等[12]的研究都认为小麦面粉中的LOX会偶联氧化面粉中的类胡萝卜素进行生物漂白，使小麦面粉具有白亮的色泽，从而使做出的面制品受到广大消费者的青睐；LOX可以增强小麦中麦谷蛋白的交联和氧化作用，提高麦类食品的口感和风味[13]；同时LOX还可以氧化面粉及面粉制品中的脂类物质，使其失去原本的麦香味，影响口感[14]。

开展小麦LOX活性的分布及其与加工品质的相关性研究是诸多小麦研究者关注的重要问题。Borrelli等[15-16]认为LOX在小麦籽粒中的分布从外到内逐渐递减，在胚和糊粉层中的活性最高。Bao等[17]研究表明，小麦中LOX的活性与全麦粉的白度呈显著正相关关系，与全麦粉的黄度呈极显著负相关，并且产地不同的小麦品种（系）间的LOX平均活性的差异较大。王慧等[18]在对安徽省淮南片参加小麦区试5个生态点的10个小麦品种（系）的研究中发现，全麦粉LOX活性与小麦粉LOX活性呈极显著正相关。Trufanov等[19]认为LOX活性与面团强度、形成时间、稳定时间和延展性呈显著负相关，与弹延比呈正相关；LOX活性过高会氧化小麦面粉中的一些营养物质，造成营养流失[20-24]。所以LOX活性较低的小麦品种有利于提高小麦面粉的营养价值。低活性LOX的小麦品种还有利于小麦种子在储藏过程中保持活力。Liu等[25]利用RNA i技术沉默了小麦LOX基因，发现小麦籽粒的LOX活性受到有效抑制。

鉴于LOX对小麦面粉及其加工品质的重要影响，筛选小麦LOX活性等位基因并开发其特异标记是进行小麦LOX遗传改良与分子育种的重要内容。Geng等[9，26]通过杂交组合中优 9507×CA9632构建的重组自交系分别在染色体1AL和4B上检测到了控制小麦LOX活性的QTL，2个基因对籽粒LOX活性的贡献率分别为13.4%～25.2%和14.3%～27.0%，并在此基础上克隆出等位基因TaLox-B1a和TaLox-B1b，这对等位基因位于普通小麦4BS上。根据等位基因TaLox-B1a和TaLox-B1b在第3外显子上1个SNP的差异开发出了1对互补的显性功能标记LOX16和LOX18[4]，这2个标记在LOX活性高和低的品种中分别扩增出489bp和791bp片段。吴萍[10]根据小麦LOX1基因本身的序列信息[27]开发了一个新功能标记LOX1-wp01，该标记可靠性强，而且采用带型统计的方法在检测中进行统计，操作方便、易于观察。综上所述，开展LOX活性研究对于小麦品质改良与分子育种都具有非常重要的作用。

本研究利用标记LOX16和LOX18对来自中国7个麦区的436份小麦种质进行分子检测，明确其在TaLox-B1位点的等位基因变异类型，并对其在不同生态区的分布规律进行分析，在此基础上，对自选高代小麦品系进行分子鉴定，以期为选育优质小麦品种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试小麦种质包括来自7个小麦主产区的436份材料和课题组自选高代品系53个（表1）。所有材料均来自河南科技大学小麦种质资源创新课题组，于2014-2016年统一种植于河南科技大学农学院农场，田间管理均按常规方法进行。

表1 供试小麦品种（系）及其麦区分布情况Table 1 Wheat cultivars (lines) from different wheat regions of China

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 每份供试材料取3粒代表性的种子培育发苗，取新鲜幼嫩的叶片，参照CATB法[28-29]提取基因组DNA，用琼脂糖凝胶电泳法进行检测。

1.2.2 STS功能标记 利用小麦4B染色体上LOX活性基因的STS功能标记LOX16和LOX18，检测不同生态区小麦的LOX活性差异。所用STS标记序列由上海生工生物工程技术服务公司合成（表 2）。

表2 小麦4B染色体上LOX基因功能标记及其引物序列Table 2 Functional markers and primer sequences of LOX gene on wheat 4B chromosome

1.2.3 PCR扩增与电泳检测 PCR反应体系20µL，含20.0mmol/L Tris-HCl （pH8.4）2µL，20.0mmol/L KCl 2µL，2mmol/L dNTPs 2µL，15mmol/L MgCl22µL，每条引物各 0.5µL，TaqDNA 聚合酶 0.3µL（1.5U），模板 DNA 2µL（80ng），ddH2O 8.7µL。反应在T100Thermal Cycler（Bio-Rad）扩增仪进行，采用Touchdown PCR程序：95℃预变性4min；95℃变性45s，65℃～53℃退火30s（每个循环降低0.3℃），72℃延伸2min，40个循环；72℃延伸5min；4℃保温。扩增产物采用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶（39∶1）电泳进行检测。缓冲液体系为1×TBE溶液，110V恒定电压电泳3h（根据扩增片段大小、带型及环境温度适当调整电泳时间），银染显影后，用Tanon Gis-2010型凝胶成像系统扫描成像并存入计算机。根据每个材料的检测结果推断其LOX活性基因类型，并进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同麦区小麦LOX基因分子检测

利用LOX16与LOX18分子标记，对436份小麦材料LOX活性等位基因进行分子检测。其中LOX16在TaLox-B1a（高LOX活性）基因型的材料中扩增出489bp的片段，在TaLox-B1b（低LOX活性）基因型的材料中无PCR扩增片段（图1）；而LOX18标记在TaLox-B1b（低LOX活性）基因型的材料中扩增出791bp的片段，在TaLox-B1a（高LOX活性）基因型的材料中无PCR扩增片段（图 2）。

图1 标记LOX16检测不同麦区部分小麦品种（系）TaLox-B1等位变异Fig.1 Allelic variation of wheat cultivars (lines) from different wheat regions tested by the marker LOX16 for TaLox-B1

图2 标记LOX18检测不同麦区部分小麦品种（系）TaLox-B1等位变异Fig.2 Allelic variation of wheat cultivars (lines) from different wheat regions tested by the marker LOX18 for TaLox-B1

2.2 不同生态区小麦LOX基因等位变异的区域分布

对436份小麦材料控制LOX活性等位基因变异进行分子检测和统计分析，共获得TaLox-B1a、TaLox-B1b和杂合型3种基因变异类型（表3）。

从表3中看出，检测出变异类型为TaLox-B1a的材料共有83份，所占比例较少，为19.0%；TaLox-B1b基因型的材料共有307份，所占比例最大，为70.4%；剩余46份变异类型为杂合型，所占比例为10.6%。

表3 不同麦区小麦TaLox-B1等位变异的分子检测Table 3 Molecular detection of alleles of wheat TaLox-B1 in different wheat regions

从整体看，含有与高LOX活性相关的基因型TaLox-B1a的数量较少。不同生态区各等位基因变异类型的分布情况也不尽相同：与高LOX活性相关的基因型TaLox-B1a在不同生态区的分布比例均较少，其中，在黄淮冬麦区、北部冬麦区和长江中下游冬麦区分布数目较多，比例分别为21.1%、19.8%和17.6%；与低LOX活性相关的基因TaLox-B1b在不同生态区的分布比例均较多，其中，在西南冬麦区和长江中下游冬麦区分布所占比例分别为87.9%和72.5%；基因型为杂合型的材料在北部冬麦区和黄淮冬麦区分布较多，分别有15份和26份，比例分别为14.2%和12.4%。

2.3 自选高代小麦品系LOX基因的分子检测

利用功能标记LOX16与LOX18对53份自选高代品系的LOX活性进行分子标记辅助选择，结果发现，自选品系仅仅得到了TaLox-B1b和杂合型2种基因变异类型，未检测到变异类型为TaLox-B1a的材料。其中，杂合型的材料所占比例最大，共有32个，所占比例为60.4%，基因型TaLox-B1b的材料21个，占比为39.6%；自选材料中不含与高LOX活性相关的基因型TaLox-B1a。因此，要想获得高LOX活性小麦品种（系），需要借助分子标记辅助选择（MAS）手段继续对后代品系进行进一步的选择与鉴定。

3 讨论

小麦品质不仅受遗传基因控制，也受环境因素影响，许多品质性状还会存在基因与环境互作的现象。小麦籽粒LOX是影响小麦面制品色泽的重要因素，了解不同生态区小麦品种（系）LOX基因等位变异类型及其分布有助于小麦LOX亲本的选配及其早代LOX基因型的选择。本研究结果显示，供试小麦材料中具有LOX活性基因型TaLox-B1a、TaLox-B1b和杂合型的频率分别为19.0%、70.4%和10.6%。相吉山等[30]对195份新疆小麦品种的研究、张钰玉等[31]对173份陕西小麦品种的研究和曹东等[32]对104份甘肃小麦品种的研究均表明：含有与高LOX活性相关的基因变异类型TaLox-B1a的比例远远低于含有与低LOX活性相关的基因变异类型TaLox-B1b，本研究的结果与其一致。造成这种结果的原因可能是由于LOX活性高的小麦籽粒往往不具有较高的耐储藏性，因而在选育过程中遭到了淘汰。在生产过程中，可以根据不同的生产加工目的，分别选育适合加工高白度小麦制品的高LOX活性的小麦，或者是具有更高的耐储藏性和营养价值更高的低LOX活性的小麦。Bai等[33]对123份新疆小麦品种的研究和张福彦等[34]对122份河南小麦品种的研究都表明，拥有TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a基因型组合的小麦品种（系）的LOX活性相对较高，而拥有TaLox-B1b/TaLox-B2b/TaLox-B3b基因型组合的小麦品种（系）的LOX活性相对较低。

本研究利用标记LOX16和LOX18对TaLox-B1位点检测，发现供试材料中存在TaLox-B1a、TaLox-B1b和杂合型3种变异类型。其中，杂合型共有46份，15份来自北部冬麦区，26份来自黄淮冬麦区，该类型的出现可能与育种家选育的品种非纯合等因素有关。

本研究利用LOX活性相关基因的功能标记LOX16和LOX18鉴定了供试材料TaLox-B1位点的等位基因变异类型，筛选出了具有高LOX活性基因位点（组合）的优质品种（系），为小麦面制品的颜色改良提供了材料基础。当我们在应用这些标记进行分子标记选择辅助育种时，若能与小麦早代材料的LOX活性直接测定相结合，则可以提高选择的可靠性和育种的准确性；另外，还需要考虑与颜色相关的其他基因、性状、环境及地域等的综合影响。

4 结论

不同麦区小麦种质在LOX活性基因TaLox-B1位点存在TaLox-B1a、TaLox-B1b和杂合型3种基因变异类型。小麦TaLox-B1基因等位变异出现频率不同，TaLox-B1a、TaLox-B1b和杂合型的检出频率分别为19.0%、70.4%、10.6%。小麦LOX活性等位变异基因在不同麦区的分布存在显著差异，其中，基因型TaLox-B1a在黄淮冬麦区、北部冬麦区和长江中下游冬麦区分布较多，基因型TaLox-B1b在西南冬麦区和长江中下游冬麦区分布较多；这为LOX活性特异种质的筛选与引种提供了参考。对自选高代品系MAS检测发现，杂合型存在比例高达60.4%，说明MAS可以在早代有效检出LOX基因等位变异位点的纯合度，提高育种目标性状的选择效率。