基于CRISPR技术的新型冠状病毒检测方法与临床转化进展

张万存，徐新秀，刘康博，张 飞，于志丹，李利锋，张耀东，秦 红，王焕民，张现伟

(1.郑州大学附属儿童医院，河南省儿童医院，郑州儿童医院，a.儿童肿瘤外科，郑州市儿童恶性肿瘤精准诊疗重点实验室，b. 河南省儿童遗传代谢性疾病重点实验室，中国 郑州 450018;2.青岛市市立医院神经内一科，中国 青岛 266011;3.河南省医疗器械检验所生物检测室，中国 郑州 450000)

冠状病毒(Coronavirus, CoVs)为正链单链RNA病毒，基因组分子量约为30 000，是基因组较大的RNA病毒。冠状病毒属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)，可划分为4个(α，β，γ和δ)冠状病毒属[1,2]。除目前肆虐全球的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)外，已知对人类具有致病性的冠状病毒有6种，分别为HCoV-OC43，HCoV-NL63，HCoVHKU1，HCoV-229E，SARS-CoV和MERS-CoV[3-6]，其中SARS-CoV与MERS-CoV具有高传播性和致病性。截至2020年12月24日，根据世界卫生组织提供的数据，全球现存确诊感染人数约21 943 537例，死亡人数约1 733 050例。目前，我国因SARS-CoV-2感染引起的新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)得到了良好的控制，但是从全球范围看COVID-19疫情仍未有缓解趋势。因为SARS-CoV-2传播能力强，一旦发现1例COVID-19患者，须对该患者接触人员进行SARS-CoV-2核酸检测，会在短时间内需要大量的检测试剂。因此，目前临床上尤其在一些经济不发达的偏远地区，迫切需求一种可以快速、灵敏、特异性好的SARS-CoV-2现场检测方法。

目前，核酸定性检测作为COVID-19确诊的标准方法，已广泛应用于COVID-19临床确诊工作中[7]。高通量测序技术(NGS)和逆转录实时荧光定量PCR(RT-PCR)是两种常用的SARS-CoV-2分子诊断方法[8-11]。mNGS最初用于SARS-CoV-2核酸序列的鉴定及其溯源分析，被认为是最重要的检测方法之一。然而，由于其成本高、检测时间长等原因，限制了其大规模的临床应用，不适合用于大规模筛查COVID-19[11，12]。RT-PCR检测方法相比于基于mNGS的方法速度更快、成本更低，然而，该技术对设备及人员要求比较高，这阻碍了其在实验室资源落后条件下的使用，并且通量低。此外，目前市售RT-PCR试剂盒质量不均，灵敏度在45%至60%。因此，在感染的早期阶段，可能需要重复检测以达确诊目的[13-17]。因此，RT-PCR和基于mNGS的核酸方法不适用于大规模人群中COVID-19的筛查。

成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR)是一种能够进行基因编辑的生物技术。近年来，CRISPR技术的等温扩增方法已被用于核酸体外诊断中。相比于常规的变温PCR，等温核酸扩增的优势在于其不需变温即可进行核酸的扩增检测，具有更快的扩增速度[18-23]。最新研究表明，基于CRISPR技术等温扩增方法可以快速、高灵敏、高特异性地检测SARS-CoV-2[24-26]。因此，基于CRISPR技术等温扩增方法有望发展为一种强大而精确的核酸检测工具检测SARS-CoV-2，用于家庭和基层医院COVID-19的筛查和监测。

1 基于CRISPR技术的核酸检测方法原理

CRISPR和CRISPR相关核酸酶(Cas)是一种RNA指导的适应性免疫系统，包含可编程Cas内切酶和CRISPR RNA (crRNAs)，可用于核酸的识别和编辑。同时，CRISPR-Cas基因编辑系统作为“变革生物技术”斩获了2020年诺贝尔奖。近年来，基于CRISPR-Cas系统的核酸检测技术发展突飞猛进，主要依赖于该系统能在单链向导RNA指引下将 Cas酶(包括Cas12a，Cas12b，Cas13a，Cas13b和Cas14)与靶序列相结合并对其进行切割的技术原理[18,27-29]。目前广泛用于核酸诊断的是CRISPR/Cas12系统和/Cas13系统，其中CRISPR/Cas12以DNA为靶点，对特异性DNA序列进行编辑。目前第一种检测系统代表是Jennifer A. Doudna团队开发的DETECTR(DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter)系统，通过RNA可以识别DNA，Cas12a酶切割单链DNA荧光报告分子，即可释放荧光信号，这种信号既可以使用荧光仪器采集，又可以做成金标抗体的侧向流层析试纸条，原理如图1(a)。而张峰团队开发的特异性高灵敏度酶报告解锁(Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing，SHERLOCK)技术结合了各种CRISPR-Cas酶(如Cas13，Cas12a和Csm6)，基于核酸等温扩增联合CRISPR/Cas核酸检测系统，可同时检测多种核酸。在识别RNA/DNA靶序列后，活化的Cas蛋白参与附近非靶标RNA的侧链切割，这使得Cas酶能够在体外通过标记RNA/DNA的非特异性降解来检测SARS-CoV-2核酸。该系统可实时、快速、特异地识别并能达到aM级别的敏感性，原理如图1(b)[19]。

图1 DETECTR方法检测SARS-CoV-2示意图(a)和SHERLOCK方法检测SARS-CoV-2示意图(b)Fig. 1 The schematic diagram of the DETECTR method for detecting SARS-CoV-2 (a) and the schematic diagram of the SHERLOCK method for detecting SARS-CoV-2 (b)

2 基于CRISPR技术的SARS-CoV-2核酸检测优势：高效、精准及可视化

临床研究表明，住院患者的病毒滴度呈逐日波动状态，且与疾病的严重程度无关[8,30]。对24个已出院的不同恢复期患者，在其再入院几天后使用商业试剂盒检测其标本中N基因和ORF1b基因的RNA均为阴性，其检测限(0.5 Mcopies·L-1)较高。然而,使用SHERLOCK系统灵敏度可达0.1 Mcopies·L-1，结果显示75%的标本S基因和41.6% ORF基因阳性，表明病人恢复期可能存在较低滴度的病毒载量[31]。因此，需要更敏感的核酸检测方法来监控这些患者。Hou等人建立了一种CRISPR-nCoV方法对SARS-CoV-2检测具有接近单拷贝的敏感性，且检测时间短于RT-PCR[9]。Broughton等人开发了SARS-CoV-2侧流检测方法，该方法使用环介导等温扩增反应(LAMP)和Cas12检测同时进行逆转录和等温扩增，在侧向流层析试纸条上显示，检测限为10 Mcopies·L-1，检测时间仅为30 min[18]。张锋等人开发的基于CRISPR的SHERLOCK SARS-CoV-2核酸检测技术，利用人工合成的SARS-CoV-2病毒RNA片段，可以在60 min内检测20～200 aM范围内靶序列[32]。因此，基于CRISPR的超灵敏方法，有望用于准确有效地监测和管理恢复期的COVID-19患者。

另一方面，对SARS-CoV-2进行特异性的核酸检测对疫情防控至关重要。Hou等人使用所建立的CRISPR-nCoV方法检测SARS-CoV-2和常见的呼吸道病原菌及病毒的DNA混合物，实验结果表明，这些干扰样本并没有引起假阳性反应。同时，利用CRISPR-nCoV方法对52例SARS-CoV-2阳性样本进行检测，结果表明，该方法的敏感性为100%；对62例SARS-CoV-2感染阴性的受试者进行检测，检测结果均为阴性。因此，CRISPR-nCoV方法是一种有前途的新SARS-CoV-2检测方法，具有高敏感性和特异性[9]。Broughton等人开发的基于CRISPR的侧向流层析检测方法(SARS CoV-2 DETECTR)，为SARS-CoV-2提供了一种快速且可视化的检测方法。研究表明，利用SARS-CoV-2 DETECTR对6名RT-PCR检测结果为阳性COVID-19患者的11份呼吸道拭子标本和来自流感患者、常见人类季节性冠状病毒感染患者及健康献血者的12份鼻咽拭子标本进行检测，与RT-PCR检测结果相比，SARS-CoV-2 DETECTR检测方法对呼吸道拭子标本中SARS-CoV-2检测的灵敏度为90%，特异度为100%，阳性预测值为100%，阴性预测值为91.7%[18]。与此同时，Patchsung等人最近的一项研究显示，利用SHERLOCK方法检测SARS-CoV-2的特异性为100%，敏感性为97%[18]。因此，基于CRISPR的方法有望用于SARS-CoV-2特异性检测。

有效控制COVID-19的全球蔓延及传播需要高效和准确的核酸检测方法。然而，目前临床SARS-CoV-2的检测，需要将标本运送到指定的实验室，对疑似COVID-19患者进行筛查和诊断，所需时间往往大于24 h。此外，临床现有检测方法通常需要昂贵的设备和训练有素的人员[32,33]。这些都不利于对COVID-19疫情提供有效的监测。因此，在COVID-19全球快速蔓延的背景下，开发用于评估疑似感染的超灵敏、廉价、便携式、不依靠专业人员和昂贵设备的检测方法，对有效监测COVID-19和疫情的防控至关重要。

近年来，研究人员开发了多种等温扩增方法，如重组酶聚合酶扩增[34-37]、环介导等温扩增[38-41]、靶标循环非酶扩增[42-44]等，由于等温扩增方法具有简单、快速及成本低等优势，已成为传统PCR方法的替代品。然而，由于非特异性扩增信号的存在，将这些方法开发为临床应用的可靠的即时诊断(point-of-care testing, POCT)仍存在挑战[27,45]。然而基于CRISPR技术的等温扩增方法可以很好地克服以上问题。Lucia等人开发了一种基于CRISPR-Cas12的诊断工具，用于检测合成的SARS-CoV-2 RNA序列，这种检测方法具有高的检测灵敏度，可对靶标序列进行快速检测，有望开发为便携式可视化检测方法[33]。Ding等人开发了AIOD-CRISPR双Cas12a(简称AIOD-CRISPR)SARS-CoV-2检测方法，引入crRNA对启动双Cas12a检测，该方法简单、快速、超灵敏，一步可视检测SARS-CoV-2。因此，AIOD-CRISPR分析具有开发下一代即时分子诊断的潜力[46]。Joung等人开发了一种简单的化学检测方法，将扩增RNA的等温PCR步骤和使用Cas酶检测SARS-CoV-2特定序列的化学反应合并在同一个试管中进行，该方法命名为SHERLOCK test in a Pot (STOPCovid)，适用于在1 h内即时检测SARS-CoV-2。STOPCovid检测方法的灵敏度可与RT-PCR的SARS-CoV-2检测方法相媲美，检测限为100 copies。使用层析试纸条显示，测试在70 min内得出结果，而使用荧光方法读取信号，整个实验仅需40 min。此外，在他们的研究中，利用STOPCovid和RT-PCR同时检测鼻咽拭子的12个阳性结果和5个阴性结果，检测结果完全一致。因此，STOPCovid可以极大地助力追踪隔离工作，特别是在医疗资源匮乏地区，这对长期公共卫生安全和有效地重新开放社会有重大意义[47]。Broughton等研发的基于CRISPR-Cas12检测试纸条可以在1 h内完成SARS-CoV-2的检测[18]。张峰团队在第一代的基础上，简化了RNA提取步骤，研制出STOPCovid.V2核酸检测试剂盒，只需15～45 min就能获得结果，同时，研究人员还开发了一款智能手机APP，帮助检测人员对侧流试纸的结果进行解读[48]。Fozouni[24]等人利用CRISPR-Cas12和CRISPR-Cas13技术，开发了利用智能手机检测SARS-CoV-2核酸的技术，从取样到手机报告结果，仅需15～30 min。因此，基于CRISPR技术的检测方法，有望开发为便携式的可视化SARS-CoV-2检测试剂盒。

快速、有效和准确地识别传染性疾病对于优化临床管理，指导感染控制和公共卫生干预措施至关重要。核酸检测的方法有很多，每种技术都有不同的优点和局限性[49-57]。理想的诊断既准确又方便，并能迅速提供检测结果，允许在无技术人员或复杂设备的情况下对多种临床标本进行检测。高致病性病毒可能在医疗资源落后地区出现，但也可能在全球范围内传播(如埃博拉病毒和中东呼吸综合征冠状病毒)，这就需要一种能够在疾病发展早期进行快速和准确检测的即时确诊方法[52]。

以IgG/IgM作为检测靶标的检测试剂盒周转时间短，不需要额外的设备或熟练的技术人员，可作为一种即时诊断方法。然而，IgG/IgM检测试剂盒假阳性率高，不适合单独临床使用。因此，有人建议IgG/IgM检测试剂盒可作为RT-PCR的补充选择[53,54]。基于CRISPR的方法整个检测过程仅需40 min，然而，基于RT-PCR的方法完成PCR程序大约需要1.5 h。mNGS方法大约需要20 h，其中文库准备8 h，测序10 h，生物信息学分析2 h。因此，与临床SARS-CoV-2常规检测方法RT-PCR和mNGS相比，基于CRISPR的检测方法检测速度更快，有望开发为SARS-CoV-2及时检测试剂盒。

与RT-PCR方法相比，基于CRISPR的检测方法具有以下优点:(1)等温扩增省去了使用昂贵的热循环设备和耗时的变温过程，具有灵敏度高及检测速度快等优势；(2)CRISPR的方法易于与其它简单的方法(如侧向流层析)相联合，省去复杂的实验室基础设施，适合开发成现场检测的方法。RT-PCR检测方法与基于CRISPR的检测方法灵敏度、特异性等对比见表1。因此，基于CRISPR的检测方法有望开发为临床检测试剂盒用于SARS-CoV-2的快速、灵敏和可视化检测，用于为医疗欠发达及偏远地区筛查和监测COVID-19。

表1 RT-PCR检测方法与基于CRISPR检测方法的灵敏度、特异性等对比表

3 基于CRISPR技术的SARS-CoV-2核酸检测临床应用

2020年5月，首款基于CRISPR技术的新冠病毒检测产品(The SherlockTMCRISPR SARS-CoV-2 kit)获美国FDA紧急使用授权[55]，该检测基于张锋团队开发的SHERLOCK技术，在鼻、口、喉拭子或肺部液体中检测SARS-CoV-2的ORF1ab和N基因片段，最低检测限可达6.75 Mcopies·L-1，检测的特异性和敏感性均为100%，且1 h之内出检测结果。另外，在国内由杭州众测生物科技有限公司联合CRISPR技术及重组酶介导链替换核酸扩增技术研发的SARS-CoV-2核酸检测试剂盒(CRISPR免疫层析法)已获批。

4 结论与展望

SARS-CoV-2在全球的迅速传播给全世界人民带来了严重的影响。目前临床上SARS-CoV-2检测可以通过RT-PCR方法进行，但基于RT-PCR的SARS-CoV-2检测方法面临如下问题：(1)试剂和设备的缺乏使得在SARS-CoV-2爆发及医疗条件欠发达地区不能及时发现与确诊。(2)检测灵敏度低，对于COVID-19恢复期患者及病毒载量比较低的患者容易出现假阴性结果。基于CRISPR的方法，如STOP，SHERLOCK和DETECTR，可以利用多种类型的标本(唾液、鼻咽拭子、呼吸道拭子、口咽拭子和支气管肺泡灌洗液)提供高灵敏度和特异性的SARS-CoV-2检测方法。此外，基于CRISPR的免疫层析法检测SARS-CoV-2具有快速、低成本、便携及可视化等优点，对于疫情爆发地区、医疗条件差及设备落后的偏远地区疫情的防控至关重要。