哈巴苷对病毒性心肌炎模型小鼠的影响*

王成攀，高峰，吴敬欣，张丽德，刘宝文

辽宁中医药大学附属医院，辽宁沈阳117000

病毒性心肌炎是一种炎症性心脏病，由导致心肌坏死的病毒感染引起的［1］，其特征为心肌的炎性浸润和心肌细胞坏死。病毒性心肌炎是严重心力衰竭的主要原因，甚至引发患者猝死［2］。柯萨奇病毒B3（coxsackievirus group B type3，CVB3）是病毒性心肌炎的主要病原因子，常用于诱导小鼠心肌炎模型，其模型与人类病毒性心肌炎有许多共同特征［3］。目前，临床上已尝试了许多治疗策略，如抗病毒、免疫抑制和抗氧化疗法治疗病毒性心肌炎，然而这些方法并没有产生足够的效果及改善患者的存活率［4］。哈巴苷是提取自中药玄参的一种环烯醚萜类活性成分，具有抗炎、神经保护、增强免疫、抑制血小板凝聚等作用［5-6］。由于哈巴苷的抗炎活性，我们考虑其是否可用于改善病毒性心肌炎。本研究旨在探讨哈巴苷对病毒性心肌炎模型小鼠的作用。

1 材料

1.1 动物90只雄性Balb／c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，5周龄，体质量（20±2）g，许可证号：SCXK（京）2016-0006，置于温度（22±2）℃，湿度55% ～75%，12 h光暗循环动物设施内饲养。

1.2 药物及试剂哈巴苷（中国食品药品检定研究院，批号：111729-201707），化学式：C15H24O10，分子量：364，纯度≥96.8）；卡托普利（中国食品药品检定研究院，货号：100318-201904）；B3型柯萨奇病毒（上海一基实业有限公司，货号：DA647049）；Eagle′s培养液（上海经科化学科技有限公司，货号：GNM-14266）；苏木素伊红染色（HE）试剂盒（上海碧云天生物技术研究所，货号：C0105）；乳酸脱氢酶（lactatedehy drogenase，LDH）试剂盒（南京建成生物工程研究所，货号：A020-2）；肌酸激酶同工酶-MB（creatine kinase lsoenzyme-MB，CK-MB）、心肌肌钙蛋白I（myocardialtroponin I，cTnI）、心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin，cTnT）测定试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，货号分别为：E006-1-1、ml001932、ml037292）；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，货号分别为：ab6671、ab100704、ab100712）；NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）抗体（美国Abcam公司，货号：ab214185）；半胱天冬酶-1（cleaved caspase-1）抗体（美国Abcam公司，货号：ab2302）；GAPDH抗体（美国Abcam 公司，货号：ab9485）。

1.3 仪器UV1900型紫外分光光度计（上海让奇仪器科技有限公司）；HBS-1096A型全自动酶标仪（北京华泰和合商贸有限公司）；KR-S80型超声诊断仪（徐州市凯尔医学仪器有限公司）；JS-power600型电泳仪（上海培清科技有限公司）；VILBER INFINITY 3026型凝胶成像仪（法国VILBER LOURMAT公司）。

2 方法

2.1 病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化模型复制将90只小鼠随机分为6组，每组15只，即对照组：第0、14、28天腹腔接种不含病毒的Eagle′s液；CVB3组［7］：第0天腹腔接种含CVB3／TCD50＝10-5的1∶2 000病毒稀释液0.2 mL，第14天腹腔接种1∶1 600病毒稀释液0.2 mL，第28天腹腔注射1∶800病毒稀释液0.2 mL；哈巴苷低剂量组：模型建立同CVB3组，第60天灌胃哈巴苷（2 mg·kg-1），持续45 d；哈巴苷中剂量组：模型建立同CVB3组，第60天灌胃哈巴苷（10 mg·kg-1），持续45 d；哈巴苷高剂量组：模型建立同CVB3组，第60天灌胃哈巴苷（20 mg·kg-1），持续45 d；卡托普利组：模型建立同CVB3组，第60天灌胃 0.2 mL 卡托普利（15 mg·kg-1），持续45 d。造模60 d后存活小鼠为病毒性心肌炎模型，第105天取外周血150μL，4℃、离心半径8 cm、3 000 rpm·min-1离心，取上清，-20℃保存待用。

2.2 超声心动图检查每组取15只小鼠，用3%水合氯醛将其麻醉，左侧卧位，采用彩色多普勒超声仪检测小鼠左室舒张期后壁厚度（LVPWd）、射血分数（EF%）、舒张早期二尖瓣血流速度（E）、舒张早期二尖瓣环运动速度（E′IVS），计算舒张早期二尖瓣血流速度与舒张早期二尖瓣环运动速度的比值。

2.3 心肌酶指标每组取10只小鼠心肌匀浆液，采用紫外分光光度计检测CK-MB、LDH、cTnI、cTnT水平。CK-MB在340 nm处测OD值，LDH、cTnI、cTnT在450 nm处测OD值。

2.4 HE染色断头法处死小鼠，取心脏用10%福尔马林固定行石蜡包埋切片。采用苏木素伊红染液进行染色：将石蜡切片脱蜡，蒸馏水润湿组织，核染液染色5 min，水洗5 s，浆染液染色30 s，水洗后，滤纸吸干，无水乙醇脱水2次后封片，在荧光显微镜下观测。

2.5 ELISA检测血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平在4℃下用50 mM的碳酸盐缓冲液溶解抗原，每孔取100μL到96孔酶标板，将抗原包被过夜，弃去包被液，用PBST洗涤3次，每次5 min，每孔加150μL的1%BSA封闭1 h，PBST洗涤3次，加入100μL不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37℃孵育2 h，PBST洗涤5次，加入100μL稀释后的HRP标记的二抗，37℃孵育1h，PBST洗涤5次后显色剂显色20 min，用酶标仪测定。

2.6 Western blot法检测心肌组织的蛋白表达取3只小鼠心肌组织置于玻璃匀浆器内匀浆，在冰上溶解25 min。以4℃、离心半径8 cm、12 000 r·min-1离心20 min，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行总蛋白提取，用BCA试剂盒测定蛋白质含量。提取等量的蛋白质样品，在100℃下变性5 min。使用SDS-PAGE凝胶电泳法分离并转移至PVDF膜，在4℃下加入相应一抗并孵育过夜，清洗，在4℃下加入辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育2 h，最后加入发光液，曝光处理。用ImageJ软件统计灰度值。

2.7 统计学方法用SPSS 17.0软件对实验数据进行统计学分析，两两比较用独立的t检验，结果以均数±标准差（±s）表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 哈巴苷对病毒性心肌炎小鼠心肌组织病理损伤程度的影响对照组心肌细胞形态正常，心肌纤维排列整齐、纹理清晰、无炎性细胞浸润；CVB3组心肌细胞核发生形变细胞断裂，心肌纤维排列紊乱、水肿、大量炎性细胞浸润，表现出明显病毒性心肌损伤；哈巴苷低、中、高剂量组和卡托普利组较CVB3组病理损伤程度均有不同程度的改善，炎性细胞浸润减少、心肌纤维排列整齐、水肿减退。见图1。

图1 哈巴苷对病毒性心肌炎小鼠心肌组织病理损伤程度的影响（HE染色，×400）

3.2 哈巴苷对病毒性心肌炎模型小鼠血清中CK-MB、LDH和cTnI、cTnT水平的影响与对照组比较，CVB3组CK-MB、LDH、cTnI、cTnT水平明显升高（P＜0.05）；与CVB3组比较，哈巴苷低、中、高剂量组和卡托普利组CK-MB、LDH、cTnI、cTnT水平明显降低（P＜0.05）。见表1。

表1 哈巴苷对病毒性心肌炎模型小鼠血清中心肌酶CK-MB、LDH和cTnI、cTnT水平的影响 （±s）

表1 哈巴苷对病毒性心肌炎模型小鼠血清中心肌酶CK-MB、LDH和cTnI、cTnT水平的影响 （±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与CVB3组比较，＃P＜0.05

组别n剂量／mg·kg-1 CK-MB（ρ／pg·L-1）LDH／IU·L-1 cTnI（ρ／pg·L-1）cTnT（ρ／pg·L-1）10-55.1±8.5 210.5±10.8 0.05±0.02 0.08±0.02 CVB3组10-137.3±24.0*576.4±45.7*0.37±0.04*0.32±0.05*哈巴苷低剂量组10 2 111.5±15.7＃447.4±36.5＃0.31±0.05＃0.29±0.04＃哈巴苷中剂量组10 10 88.4±9.6＃355.2±42.8＃0.28±0.03＃0.21±0.03＃哈巴苷高剂量组10 20 72.5±8.3＃230.8±16.3＃0.22±0.03＃0.13±0.02＃卡托普利组10 15 84.8±7.4＃247.0±25.5＃0.24±0.04＃0.18±0.02对照组＃

3.3 哈巴苷对CVB3诱导的病毒性心肌炎模型小鼠心功能的影响与对照组比较，CVB3组LVPWD、E／E′IVS明显升高（P＜0.05），EF%明显降低（P＜0.05）；哈巴苷低、中、高剂量组和卡托普利组LVPWD、E／E′IVS明显低于CVB3组（P＜0.05），CVB3组EF%明显低于哈巴苷低、中、高剂量组和卡托普利组（P＜0.05）。见表2。

表2 哈巴苷对CVB3诱导的病毒性心肌炎模型小鼠心功能的影响 （±s）

表2 哈巴苷对CVB3诱导的病毒性心肌炎模型小鼠心功能的影响 （±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与CVB3组比较，＃P＜0.05

组别n 剂量／mg·kg-1 LVPWD（l／mm）EF%E／E′IVS对照组15-0.75±0.08 58.1±6.5 19.2±2.3 CVB3组15-1.26±0.09* 40.5±5.4* 46.6±5.5*哈巴苷低剂量组 15 2 1.15±0.05＃ 43.3±4.8＃ 40.8±4.6＃哈巴苷中剂量组 15 10 1.09±6.4＃48.8±5.0＃ 37.3±4.1＃哈巴苷高剂量组 15 20 0.95±6.3＃54.8±5.9＃ 28.4±3.4＃卡托普利组15 15 0.86±6.7＃50.2±5.4＃ 25.0±3.2＃

3.4 哈巴苷对CVB3诱导的病毒性心肌炎模型小鼠炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影响与对照组比较，CVB3组TNF-α、IL-6、IL-1β水平明显升高（P＜0.05）；哈巴苷低、中、高剂量组和卡托普利组TNF-α、IL-6、IL-1β水平明显低于CVB3组（P＜0.05）。见表3。

表3 哈巴苷对CVB3诱导的病毒性心肌炎模型小鼠炎症 因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影响 （±s，ng·L-1）

表3 哈巴苷对CVB3诱导的病毒性心肌炎模型小鼠炎症 因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影响 （±s，ng·L-1）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与CVB3组比较，＃P＜0.05

组别n剂量／mg·kg-1 TNF-αIL-6 IL-1 β 10-46.1±5.3 149.1±12.51 97.2±14.3 CVB3组10-115.3±20.5*580.1±59.4* 635.6±64.5*哈巴苷低剂量组 10 2 65.6±4.5＃ 436.3±33.8＃ 560.8±55.6＃哈巴苷中剂量组 10 10 52.9±6.4＃ 372.8±35.0＃ 384.3±38.1＃哈巴苷高剂量组 10 20 41.5±6.3＃ 314.8±25.9＃ 212.4±24.4＃卡托普利组10 15 40.7±6.7＃ 310.2±10.4＃ 161.0±13.2对照组＃

3.5 哈巴苷对CVB3诱导的病毒性心肌炎模型小鼠NLRP3、cleaved caspase-1蛋白水平的影响与对照组比较，CVB3组NLRP3、cleaved caspase-1蛋白水平明显升高（P＜0.05）；哈巴苷低、中、高剂量组和卡托普利组NLRP3、cleaved caspase-1蛋白水平明显低于CVB3组（P＜0.05）。见表4、图2。

表4 哈巴苷对CVB3诱导的病毒性心肌炎模型小鼠NLRP3、cleaved caspase-1蛋白水平的影响 （±s）

表4 哈巴苷对CVB3诱导的病毒性心肌炎模型小鼠NLRP3、cleaved caspase-1蛋白水平的影响 （±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与CVB3组比较，＃P＜0.05

组别n 剂量／mg·kg-1 NLRP3 cleaved caspase-1对照组3-0.20±0.03 0.12±0.02 CVB3组3-1.45±0.16*1.33±0.15*哈巴苷低剂量组 3 2 1.02±0.09＃0.98±0.10＃哈巴苷中剂量组 3 10 0.81±0.10＃0.83±0.09＃哈巴苷高剂量组 3 20 0.42±0.05＃0.48±0.06＃卡托普利组3 15 0.22±0.03＃0.31±0.04＃

图2 NLRP3、cleaved caspase-1蛋白水平

4 讨论

以心肌炎症为特征的病毒性心肌炎是心脏病学中最具挑战性的临床问题之一。据估计，40岁以下患者猝死的比例高达12%［8］，其中，CVB3是病毒性心肌炎的主要原因。由于适当的感染控制措施仍然无法完全用于CVB3感染，因此心肌炎患者常常发展为慢性扩张型心肌病，最终死于心力衰竭［9］。目前，临床尚无治疗病毒性心肌炎的特效药物，以营养心肌、改善症状、稳定心肌酶及对症治疗为主［10］。本研究采用CVB3病毒制备病毒性心肌炎小鼠模型，给予不同剂量的哈巴苷进行干预，明确药物的剂量效应关系。研究发现，CVB3诱导的小鼠心肌组织具有病理损伤，而哈巴苷低、中、高剂量组均可有效改善病毒性心肌炎小鼠心肌细胞病理指标，改善LVPWD、EF%、E／E′IVS等心室重构指标，说明哈巴苷对CVB3诱导的心肌组织损伤具有保护作用。

心肌酶谱变化被认为是病毒性心肌炎的诊断指标之一，具有重要的临床意义，其中LDH 和CK-MB是用于评估心肌酶水平的参数［11］，cTnT是用于心肌炎诊断评估的敏感生物标志物［12］，高水平的cTnI与严重心肌炎的临床和超声心动图证据相关［13］。Zhang Y等［14］研究发现，MicroRNA-381通过靶向环氧合酶-2降低CK-MB和LDH水平，从而抑制CVB3诱导的心肌细胞损伤。Zhang Z等［15］研究发现，黄芪通过降低CK-MB和cTnI水平改善病毒性心肌炎儿童外周Treg细胞免疫失衡。本研究表明，哈巴苷有降低CK-MB、LDH、cTnI、cTnT水平的作用，说明其可通过调节心肌酶对CVB3诱导的病毒性心肌炎起到治疗作用。

病毒性心肌炎的特征在于心肌过度炎症导致心脏损伤，在病毒感染过程中，由心肌细胞和浸润的炎性细胞产生的细胞因子和趋化因子对于疾病进展是重要的［16］。心肌细胞中的病毒感染引发促炎细胞因子的表达，包括TNF-α、IL-6、IL-1β和趋化因子，这些细胞因子招募和积聚在受感染的心脏强烈促进促炎症细胞因子的表达，并进一步激活免疫细胞，导致心脏大量炎症和严重伤害［17］。Li SG等［18］研究发现，尼古丁以剂量依赖的方式通过下调TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子水平以降低CVB3诱导的病毒性心肌炎的严重程度。Li-Sha G等［19］研究发现，卡维地洛通过降低TNF-α、IL-6水平改善CVB3诱导的病毒性心肌炎。本研究发现，哈巴苷具有降低炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平的作用，推测哈巴苷对CVB3诱导的病毒性心肌炎具有治疗作用。

NLRP3炎症小体是一种胞内蛋白复合体，由NLRP3、凋亡相关点样蛋白（ASC）和半胱天冬酶-1前体（pro-caspase-1）组成，NLRP3可以调控IL-1β的表达，NLRP3激活后产生活化的cleaved caspase-1，进而将IL-1β前体加工为成熟状态，引起炎症反应［20］。相关研究表明，CVB3诱导的病毒性心肌炎中，由ROS和K+外流引发的NLRP3炎性小体激活在发病过程中可能是至关重要的［21］。Tschope C等［22］研究发现，敲除NOD2可减少CVB3诱导的病毒性心肌炎中NLRP3的生成，使ASC、CARD、caspase-1、IL-1β的表达下调改善病毒性心肌炎。本研究发现，哈巴苷具有下调NLRP3、cleaved caspase-1的蛋白水平，说明哈巴苷通过下调NLRP3、cleaved caspase-1水平改善CVB3诱导的病毒性心肌炎炎症。

本研究揭示了哈巴苷对CVB3诱导的病毒性心肌炎小鼠的作用。即通过改善心肌组织病理损伤程度，降低血清中心肌酶CK-MB、LDH和cTnI、cTnT水平，降低LVPWD、E／E′IVS，升高EF%，降低炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平，下调NLRP3、cleaved caspase-1蛋白表达，发挥对CVB3病毒性心肌炎小鼠的保护作用。