反相高效液相色谱法同时测定利肝宁片中对羟基苯乙酮和绿原酸的含量*

覃芳，李广胜，郭兴辉，胡文文，刘会丽

1.河南中医药大学第三附属医院，河南 郑州450008；2.河南省食品药品检验所，河南 郑州450003

利肝宁片，由茵陈、虎杖、黄连、板蓝根、白芍、木香、水红花子、茯苓、砂仁、半夏等中药组成。纵观全方，熔清热解毒、祛湿退黄、养血破瘀、理气消痞为一炉，标本兼顾，共奏清肝利胆，健脾和胃之功。临床验证，对慢性肝炎湿热中阻证疗效显著。

本方根据张仲景及吴鞠通论“黄疸”和“湿热中阻”的辨证理论，结合慢性肝炎病程长及临床表现多变的特点，选用张仲景清肝利胆之茵陈蒿汤和吴鞠通治疗湿热中阻的“辛开苦降”之法而组成本方［1-2］。该方20世纪80年代为汤剂应用于临床，1990年改为蜜丸，1991年改为片剂后申报为河南省重点科技攻关项目。1993年经河南省卫生厅药政处与广西省卫生厅药政处委托解放军303医院临床观察，有效率为85.3%。1995年申报郑州市卫生局批准为医院制剂使用。该方由汤剂演变成片剂，历经20余年。制成片剂后，疗效确切，服用方便，价格适中，取得了良好的经济效益和社会效益，深受患者好评。

目前，未见利肝宁片质量控制的相关资料，据文献报道，对羟基苯乙酮和绿原酸为利肝宁片主药茵陈药材利胆药效的有效成分，明确其含量范围是控制本药质量的关键。现参考相关文献资料，对利肝宁片中指标性成分对羟基苯乙酮和绿原酸的含量测定方法学进行研究［3］。

1 仪器与药品

1.1 仪器美国Agilent公司1260高效液相色谱仪，chemStation色谱工作站；1310A-IsoPump；G1314A VWD检测器；上海梅特勒-托利多公司Mettle AE240电子分析天平［4-7］。

1.2 药品对羟基苯乙酮对照品（中国食品药品检定研究院，纯度：99.9%，批号：111897-201602）；绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，纯度：96.8%，批号：110753-201817）；利肝宁片（批号：20180501，20180601，20180701）由河南中医药大学第三附属医院制剂室提供，除乙腈为色谱纯外，其余试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。

2 实验方法

2.1 色谱条件色谱柱：安捷伦ZORBAX Eclipse XDB C18（4.6 mm×250.0 mm，5μm）；流动相：（体积分数）0.05%磷酸溶液-乙腈（90∶10）；检测波长：275 nm（对羟基苯乙酮）和327 nm（绿原酸）；柱温：35 ℃；流 速：1.0 mL· min-1；进 样 量：20μL［8-16］。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备［17-23］对羟基苯乙酮对照品溶液制备：精密称取对羟基苯乙酮对照品10.18 mg，转移至20 mL容量瓶中，加入体积分数70%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀后制成对羟基苯乙酮对照品的储备液。移液管精密量取对照品的储备液1 mL，转移至50 mL容量瓶，加流动相稀释至刻度，摇匀，得对羟基苯乙酮对照品溶液，备用。

绿原酸对照品溶液制备：精密称取绿原酸对照品10.65 mg，转移至25 mL容量瓶中，加入体积分数70%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀后得绿原酸对照品储备液；移液管精密量取对照品储备液1 mL，转移至10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，得绿原酸对照品溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备取利肝宁片20片，精密称定，置于研钵中研细，精密称取约4片质量细粉，置于具塞锥形瓶中，并精密量取50 mL体积分数70%甲醇。调整超声设备功率140 W，频率42 kHz后进行处理30 min，取出，放冷，再进行质量称定。用体积分数70%甲醇补足减失的质量，摇匀后离心，并取上清液过滤，取滤液备用。

2.2.3 阴性对照溶液的制备取缺茵陈的阴性样品10片，按2.2.2供试品溶液制备方法操作，制备阴性对照品溶液。

3 结果

3.1 系统适用性实验各量取20μL的绿原酸对照品溶液、对羟基苯乙酮对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，分别注入色谱仪，以2.1项下的色谱条件为检测条件，测定并记录。在275 nm波长下，供试品溶液中对羟基苯乙酮的保留时间为30.8 min，理论板数按对羟基苯乙酮峰计算7 854，对羟基苯乙酮峰与其他峰分离度符合要求，且在对羟基苯乙酮对照品出峰位置阴性对照品无色谱峰出现。在327 nm波长下，供试品溶液中绿原酸的保留时间为14.7 min，理论板数按绿原酸峰计算9 235，绿原酸峰与其他峰分离度符合要求。在绿原酸对照品保留时间相应的位置上，阴性对照品溶液没有出现色谱峰。由此可见，在利肝宁片的处方中，其他药材对羟基苯乙酮和绿原酸的含量测定不产生干扰。见图1。

3.2 线性关系实验精密量取对羟基苯乙酮对照品储备液0.25 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL置50 mL容量瓶中，加体积分数70%甲醇稀释至刻度，分别制成浓度为2.545 mg·L-1、5.09 mg·L-1、10.18 mg·L-1、15.27 mg·L-1、20.36 mg·L-1的标准溶液，按2.1项下色谱条件进样，每个浓度连续进样2次，求峰面积平均值。以质量浓度对峰面积作图，结果经回归分析得回归方程：Y＝44.915X+10.007，r＝0.999 7。结果表明，对羟基苯乙酮对照品溶液在2.545～20.360 mg·L-1内与峰面积成良好的线性关系。

精密量取绿原酸对照品储备液0.25 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL置10 mL容量瓶中，加体积分数70%甲醇稀释至刻度，分别制成浓度为10.31 mg·L-1、20.62 mg·L-1、41.24 mg·L-1、61.86 mg·L-1、82.47 mg·L-1的标准溶液，按2.1项下色谱条件进样，每个浓度连续进样2次，求峰面积平均值。以质量浓度对峰面积作图，结果经回归分析得回归方程：Y＝8.803 5X+1.684 8，r＝0.999 8。结果表明，绿原酸对照品溶液在10.31～82.47 mg·L-1内与峰面积成良好的线性关系。

图1 利肝宁片高效液相色谱图

3.3 检出限实验分别取3.2线性关系实验项下的溶液，逐级稀释，按2.1项下色谱条件进样20μL，信噪比S／N为3时，对羟基苯乙酮的检出限为：20.4 ng；绿原酸的检出限为：41.2 ng。

3.4 精密度实验分别精密量取对羟基苯乙酮对照品储备液0.2 mL和绿原酸对照品储备液1 mL置同一10 mL容量瓶中，加体积分数70%甲醇稀释至刻度，制成每1 mL含对羟基苯乙酮10.18μg和绿原酸41.24μg的混合对照品溶液，连续进样6次，峰面积平均值分别为465.3和360.3，RSD分别为0.9%和1.2%，表明该方法精密度良好。

3.5 稳定性实验取2.2.2项下供试品溶液，分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h测定，对羟基苯乙酮和绿原酸的峰面积均值分别为296.8和285.1，RSD分别为1.1%和1.3%，表明供试品溶液制备后10 h内基本稳定。

3.6 重复性实验精密称取样品6份，样品批号：20180501。按2.2.2项下的方法制备供试品溶液，并按2.1项下色谱条件测定含量，对羟基苯乙酮和绿原酸的平均含量分别为每片0.08 mg和0.35 mg，RSD分别为1.4%和1.2%，表明该方法重复性良好。

3.7 回收率实验精密称取本品（批号：20180501）6份（每份约相当于2片质量），置具塞锥形瓶中，每份精密加入对羟基苯乙酮对照品和绿原酸对照品适量，精密加入体积分数70%甲醇50 mL，称定质量，按2.2.2项下的方法制备供试品溶液，分别进样，按外标法计算含量和回收率，结果见表1、表2。

表2 绿原酸回收率实验结果

3.8 样品含量测定分别取样品（批号：20180501，20180601，20180701）细粉适量（约相当于利肝宁片4片质量），按2.2.2项下方法制备供试品溶液，测定含量，结果每片对羟基苯乙酮含量分别为：0.081 mg、0.080 mg、0.082 mg；绿原酸含量分别为：0.35 mg、0.36 mg、0.35 mg。

4 方法探讨

4.1 检测波长的选择利肝宁片化学成分复杂，通过供试品溶液全波长紫外图谱可知对羟基苯乙酮在275 nm波长处有最大吸收，绿原酸在327 nm波长处有最大吸收，为提高被检测成分的灵敏度和准确度，分别选择各自的最大吸收波长作为检测波长，进行两个波长同时检测，实现对羟基苯乙酮和绿原酸的同时测定。

4.2 色谱条件的选择查阅相关文献，对比筛选磷酸溶液的pH值、浓度和乙腈的比例对分离结果的影响，最终确定（体积分数）0.05%磷酸溶液-乙腈（90∶10）为流动相条件进行实验分析。同时考察不同品牌型号的色谱柱对分离效果的影响，最终选择安捷伦ZORBAX Eclipse XDB C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱，主成分保留时间适中，分离效果好。

4.3 提取方法的选择近年来中药浸提新方法、新技术不断涌现，并被广泛推广应用，使中药制剂的质量不断提高。如加压逆流提取法、半仿生提取法、旋流提取法、超临界流体萃取技术、超声提取技术、微波萃取技术及高速逆流色谱提取技术等。本实验参考相关文献资料，选择超声提取法和传统回流提取法，提取后进行对比发现二者并无显著差异。超声提取法的优势在于，利用超声波增大物质分子运动频率和速度的原理，使溶剂穿透力增加，药物溶出速度和溶出次数得到提高，缩短了提取时间，并且提取所用设备操作简单，供试品受热温度低，被测成分稳定性好，故最后选择了超声提取法。另对提取溶剂和提取时间进行考察，采用体积分数50%、70%和100%的甲醇为提取溶剂，分别超声提取30 min、60 min、120 min，结果体积分数70%的甲醇提取效率最高，超声时间对含量测定结果基本无影响，故提取方法最终确定为选择体积分数70%的甲醇为溶剂超声提取30 min。

5 讨论

乙型肝炎病毒（hepatitis b virus，HBV）慢性感染有高度的种属和组织特异性，HBV慢性感染会导致不可逆的肝细胞炎性坏死和纤维化，最终进展为肝硬化或肝癌。近年来，治疗慢性乙型病毒性肝炎领域的一大突破，就是已经认识到只有从根本上抑制HBV的复制才能够明显延缓疾病的进展，并据此开发出了很多新型的抗病毒药物，把病毒复制量控制在比较低的水平，但很多药物存在耐药问题，一旦抗病毒药耐药将无法继续控制HBV的复制［24］。目前对HBV的感染尚无有效的彻底治愈手段。

近年来研究显示，中医利用其整体辨证论治的核心理念治疗慢性乙型病毒性肝炎，标本兼治，不仅改善症状，还通过调理机体提升免疫力，延缓疾病进展、改善患者生活质量。中医治疗慢性乙型病毒性肝炎具有其独特的优势。

利肝宁片的组方是李学斌教授的经验方，应用临床多年，疗效显著。方中茵陈苦、微寒，归肝、胆、脾、胃经，清热利湿，为退黄要药，常用于治疗湿疮瘙痒、黄疸尿少及传染性黄疸型肝炎。大量文献报道，绿原酸、咖啡酸和对羟基苯乙酮为茵陈药材利胆作用的有效成分［25］。

本实验利用RP-HPLC法测定利肝宁片中对羟基苯乙酮和绿原酸的含量。选用绿原酸和对羟基苯乙酮的最大吸收波长为检测波长进行双波长检测，最大程度减少其他成分对检测成分的干扰。流动相选择（体积分数）0.05%磷酸溶液-乙腈（90∶10），在选定的色谱条件下，对羟基苯乙酮和绿原酸的保留时间分别是30.8 min和14.7 min，目标峰与其他峰分离度良好，且在该时间点阴性对照品无其他干扰峰出现。该实验为利肝宁片的质量控制提供了有效方法，对进一步明确其疗效补充了理论依据。