参附注射液对大鼠阿霉素心肌损伤的影响*

王宏波，杨冬梨，徐宗佩，李玉红

天津中医药大学，天津300193

阿霉素（doxorubicin，DOX）属于第二代蒽环类高效广谱抗肿瘤抗生素，临床广泛应用于血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤的治疗［1-3］，但因其出现的剂量依赖性心脏毒性，限制了其临床应用［4-5］。研究表明，线粒体是DOX心脏损伤最主要的细胞器，DOX诱导的心脏功能紊乱主要是线粒体损伤和功能障碍［6］。作为许多生理生化过程必不可少的场所，如氧化磷酸化、三羧酸循环、脂肪酸的β-氧化、钙处理和血红素生物合成等，线粒体在细胞代谢中起着中心调节的作用［7］。线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）开放被认为是造成DOX心肌线粒体损伤的决定因素［8］。以抑制mPTP开放，降低线粒体肿胀为主的线粒体途径干预DOX心脏毒性成为心肌保护药物的研究热点。

参附注射液（shenfu injection，SFI）源自《校注妇人良方》之参附汤，由红参和黑附片提取物制成，主要含有人参皂苷和乌头类生物碱［9］，具有益气固脱、振奋心阳之功效，是心血管系统疾病的临床常用药物，具有很好的心肌保护作用［10-15］。临床及动物实验研究［16-17］均表明，SFI能改善肿瘤患者放化疗后的生活质量，减轻阿霉素的心脏损伤但不降低其疗效，常作为肿瘤患者放化疗后的辅助用药［18-19］。本实验采用皮下注射DOX诱导大鼠心肌损伤，旨在观察SFI是否能通过改善心肌线粒体呼吸功能障碍，减轻DOX的心脏损伤，从线粒体角度探讨其潜在的机制。

1 材料

1.1 动物清洁级健康SD雄性大鼠，6～8周龄，体质量为220～240 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证编号：SCXK（京）2012-0001。饲养于中国医学科学院放射医学研究所，室温20～25℃，相对湿度40% ～60%，并以实验动物中心标准饲料进行喂养。动物伦理审核编号：TCM-LAEC2019042。

1.2 药物与试剂SFI（雅安三九药业有限公司，批号：20043116）；阿霉素（深圳万乐药业有限公司，批号：H44024359）；9 g·L-1氯化钠注射液（中国大冢制药有限公司，批号：20181206）。

1.3 仪器Oxygraph-2k型线粒体呼吸测量仪（奥地利Oroboros公司）；INFINITEF50型多功能读板机（瑞士TECAN公司）；JA1003型电子分析天平（上海天平仪器）；台式冷冻离心机（美国Thermo公司）；DW-86L38型立式超低温保存箱（青岛海尔特种电器有限公司）；Vevo2100TM型超高分辨率小动物超声实时影像系统（加拿大Visual Sonics公司）。

2 方法

2.1 造模及给药方法SD雄性大鼠按体质量随机分为5组，每组12只，分别为空白（SAL）组、空白参附（SAL+SFI，5 mL·kg-1）组、模型（DOX）组、参附高剂量（DOX+SFI，5 mL·kg-1）组、参附低剂量（DOX+SFI，1 mL·kg-1）组。DOX组及DOX+SFI组给予皮下注射阿霉素（2 mg·kg-1），每周1次，共7周，建立心脏损伤模型［20-21］。停止注射DOX后1周处死动物。SAL组给予等容积的无菌生理盐水，加用SFI组在DOX损伤前一天开始腹腔注射SFI，持续给药5 d，大鼠在造模和给药过程中均未出现死亡，确保每组最终大鼠数量12只。

2.2 心脏生化指标的检测最后一次给予阿霉素或生理盐水后第7天，麻醉大鼠，仰卧体位，快速打开胸腔，取出心脏，冲洗、拭干，称其体质量。分离约20～25 mg的心肌组织，在20 mmol·L-1的Tris／KCl匀浆液中低温匀浆，3 000 g离心10 min，上清液储存于-80℃冰箱用于生化检测。心脏超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）用WST-8法进行检测。

2.3 心脏线粒体的制备采用差速分级离心法分离心肌线粒体。将大鼠心肌组织剪为碎块放入玻璃匀浆器内，加入冰水预冷的匀浆介质，0℃冰浴研磨组织，将组织匀浆物转移到离心管，1 000×g离心5 min；取上清，1 000×g再次离心5 min；取上清12 000 g离心10 min，线粒体沉淀在管底，弃上清，取沉淀，加入冰水预冷的store buffer，混悬线粒体，所有离心均在4℃进行。用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白含量，制备的线粒体4 h内用于实验。

2.3.1 线粒体呼吸功能的测定使用细胞呼吸测量仪检测线粒体呼吸，根据氧耗曲线，记录态Ⅲ和态Ⅳ呼吸速率，并计算态Ⅲ与态Ⅳ的呼吸速率（nmolO2·min·mg pro-1）之比，即为线粒体呼吸控制率（respiratory control ratio，RCR）。

2.3.2 线粒体肿胀的检测线粒体肿胀以线粒体在200μmol·L-1的CaCl2作用下肿胀产生的吸光度（A520）变化值表征。取线粒体用线粒体肿胀液稀释至0.5 g·L-1，在25℃下取200μmol·L-1的CaCl2作用于线粒体，10 min内观察在520 nm处线粒体吸光度的变化值，该变化反映线粒体肿胀程度，提示mPTP的开放情况。

2.4 统计方法采用SPSS 24.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，单因素方差分析及LSD-t检验进行统计学处理。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 体质量、心脏质量及心脏指数与SAL组比较，DOX组大鼠体质量及心脏质量明显降低（P＜0.05），心脏指数有下降趋势（P＞0.05）；与DOX组比较，参附高低剂量组大鼠体质量、心脏质量、心脏指数有升高趋势（P＞0.05）。见表1。

表1 SFI对大鼠体质量、心脏质量及心脏指数的影响 （±s，n＝12）

表1 SFI对大鼠体质量、心脏质量及心脏指数的影响 （±s，n＝12）

注：与SAL组比较，*P＜0.05

组别 体质量／g心脏质量／g 心脏指数SAL组514.22±23.59 1.38±0.09 2.68±0.17 SAL+SFI5组 522.22±27.45 1.38±0.07 2.62±0.11 DOX组381.00±13.00* 1.04±0.05* 2.61±0.40 DOX+SFI5组 386.17±24.79 1.10±0.06 2.65±0.26 DOX+SFI1组408.00±25.15 0.97±0.06 2.66±0.33

3.2 线粒体呼吸及肿胀与SAL组比较，DOX组大鼠线粒体态Ⅲ呼吸速率明显降低（P＜0.05），心脏线粒体更容易肿胀；与DOX组比较，参附高剂量组大鼠的线粒体态Ⅲ呼吸速率有升高趋势，也有降低线粒体肿胀的趋势（P＞0.05）。SFI对正常大鼠RCR有升高的趋势，DOX损伤后RCR下降，SFI对DOX造成的RCR下降有一定的改善作用。见表2。

表2 SFI对线粒体呼吸的影响 （±s，n＝12）

表2 SFI对线粒体呼吸的影响 （±s，n＝12）

注：与SAL组比较，*P＜0.05

组别 态Ⅲ 态ⅣRCR 肿胀SAL组429.39±115.20 72.16±26.65 4.70±0.71 0.035±0.017 SAL+SFI5组 403.23±187.36 67.93±32.75 5.51±1.82 0.027±0.006 DOX组241.05±80.84* 85.13±36.82 4.29±0.39 0.043±0.014 DOX+SFI5组 300.06±158.70 82.53±29.86 4.74±0.75 0.031±0.009 DOX+SFI1组 226.90±66.80 77.89±50.80 4.81±0.98 0.043±0.018

3.3 SFI对心肌SOD活性的影响与SAL组比较，DOX组大鼠心脏T-SOD、CuZn-SOD、Mn-SOD与SAL组比较，无明显变化（P＞0.05）；与DOX组比较，DOX+SFI5组心脏CuZn-SOD明显升高（P＜0.05）。见表3。

表3 SFI对心肌SOD活性的影响 （±s，n＝12）

表3 SFI对心肌SOD活性的影响 （±s，n＝12）

注：与DOX组比较，*P＜0.05

T-SOD CuZn-SOD Mn-SOD SAL组组别15.89±0.87 5.07±0.70 10.82±1.19 SAL+SFI5组16.64±0.83 4.82±1.16 11.75±1.37 DOX组16.85±0.41 5.13±0.71 11.72±0.91 DOX+SFI5组16.55±0.49 6.29±1.48* 10.25±1.43 DOX+SFI1组15.53±1.20 7.42±2.65*8.11±3.24

4 讨论

mPTP是存在于线粒体内外膜之间的一种非特异性通道，是线粒体内外信息交流的重要枢纽。mPTP是由多种蛋白质组成的复合体，根据细胞环境不同，mPTP有3种开放状态：①完全关闭状态，线粒体跨膜电位（△Ψm）稳定；②可逆的低水平开放状态，仅允许相对分子量小于300Da的物质通过，△Ψm可逆性降低；③不可逆的高水平开放状态，使相对分子质量小于1 500 Da的物质通过线粒体内膜，△Ψm不可逆的降低［22］。当心肌细胞遭受损伤时，线粒体mPTP开放是导致线粒体功能障碍、诱导细胞凋亡和坏死的主要因素［23］。众多研究证实，mPTP开放引起的线粒体肿胀、破裂是引起心肌缺血再灌注损伤的关键因素，缺血心肌的功能恢复也与mPTP开放程度相关，故抑制其开放成为心肌保护作用的最终效应器［24］。

研究表明，DOX诱导的心脏功能紊乱主要与线粒体的损伤及其相关的氧化损伤和凋亡相关［25-27］，其心脏毒性的病理生理机制主要是损伤了线粒体复合物Ⅰ的氧化还原反应，导致氧化应激反应增加，线粒体呼吸和磷酸化被抑制，干扰了细胞内的钙稳态［28］。线粒体钙超载及氧化应激是诱导mPTP开放的主要因素，而阿霉素造成心脏线粒体氧化应激及细胞内钙紊乱，形成了有利于mPTP开放的条件，最终导致mPTP开放、线粒体损伤。mPTP的开放伴随着线粒体膜电位降低，线粒体膨胀、外膜破裂和一系列前凋亡因子的释放，最终导致细胞凋亡［23］。有研究报道，SFI具有降低内毒素血症大鼠肠上皮细胞线粒体膜电位的作用［29］。RCR是评价线粒体结构和功能完整性及氧化磷酸化效率的重要指标。本实验结果显示，阿霉素促进mPTP的开放导致大鼠心脏线粒体肿胀，抑制大鼠心脏线粒体态Ⅲ呼吸，降低了RCR。给予SFI后，上述指标有一定程度改善，说明SFI具有一定的保护心肌细胞线粒体免受阿霉素损伤的作用。

SOD通过把有害的超氧自由基转化为过氧化氢和氧气，而后在过氧化氢酶和过氧化物酶的作用下将过氧化氢分解为水，从而起到清除自由基的作用。有研究报道SFI能够增加大鼠心肌SOD含量、减少丙二醛（malondialdehyde，MAD）含量、抑制蛋白凋亡，从而改善心力衰竭大鼠氧化应激水平［30］。亦有研究发现，SFI可明显改善阿霉素所致心衰大鼠的心功能，保护机制可能与抗氧化及降低血管紧张素Ⅱ的含量有关［31］。本研究发现，SFI有升高大鼠心肌CuZn-SOD的趋势，表明SFI可能通过增强SOD活性而发挥抗氧化作用起到心脏保护的作用。

综上所述，阿霉素抑制了大鼠心肌线粒体呼吸功能，高剂量的SFI可改善阿霉素损伤大鼠的线粒体肿胀程度，升高CuZn-SOD，但SFI抗阿霉素心脏毒性机制研究还需要进一步探索。