基于GRP78-ATF6-CHOP通路研究雷公藤多苷对坏死性小肠结肠炎新生大鼠的影响*

高鹏，周凤蕊，刘俊华，周川

1.郑州市第六人民医院，河南 郑州450015；2.郑州大学第二附属医院，河南 郑州450000

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是临床常见的新生儿急重症，尤其是早产儿、低体质量儿发病率更高，已成为导致新生儿死亡的重要疾病之一［1-3］。NEC以小肠、结肠弥漫性或局部坏死为典型特征，至今尚无有效的治疗手段，探讨其发病机制，寻找有效干预手段对改善NEC预后有重要临床意义。研究表明，除肠道菌群紊乱外，肠道促炎及抗炎因子失衡与NEC发生、发展关系密切［4-5］。随着对中医药研究的深入，发现中药在抗炎、调节机体免疫方面发挥着重要作用。雷公藤是临床常用的活血化瘀、解毒消肿药物，其主要活性成分雷公藤多苷已被证实具有抗炎和免疫调节作用［6-8］。雷公藤多苷常用于治疗溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎等炎症性疾病［9-10］，但其对NEC的研究较少。本研究应用新生大鼠人工喂养联合缺氧冷刺激的方法建立NEC模型，观察不同剂量的雷公藤多苷对其肠道菌群的影响，并探讨具体的调控机制，为临床新生儿NEC的治疗提供依据。

1 材料

1.1 动物SPF级SD新生大鼠55只，雌雄不限，1～2日龄，体质量5～10 g，由郑州大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（豫）2018-0001。饲养于12 h／12 h明暗交替，24～26℃，相对湿度（55±1）%条件下。实验操作符合动物伦理学，伦理号：2019005703127。

1.2 药物及试剂雷公藤多苷片（江苏美通制药有限公司，批号：20190320）；雅培婴儿配方奶粉、雅培蛋白粉（美国雅培公司，批号分别为：57713T26、61485C15）；脂肪乳（德国费森尤斯卡比华瑞制药有限公司，批号：20203927）；白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（美国R＆D公司，批号分别为：VAL601、M600B、ML-Elisa-1421）；BCA蛋白定量分析试剂盒（美国Thermo公司，批号：23209）；兔抗大鼠葡萄糖调节蛋白78（GRP78）单抗、兔抗大鼠激活转录因子6（ATF6）多抗、兔抗大鼠增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）单抗（美国Abcam公司，批号分别为：ab21685、ab203119、ab194533）；山羊抗兔GRP78、ATF6、CHOP单抗（美国Abcam公司，批号分别为ab227865、ab37149、ab265760）。

1.3 仪器SM2235型徕卡切片机（德国徕卡显微系统贸易有限公司），3550UV型酶标仪、Powerpac Universal通用型电泳仪（美国Bio-rad公司）。

2 方法

2.1 NEC模型建立取55只新生大鼠，出生48 h后与母鼠分离，放置保育箱中，给予配方奶（雅培婴儿配方奶粉4.741 g+雅培蛋白粉9.5 g+200 g·L-1的脂肪乳48.8 mL，双蒸水补充至100 mL）喂养。首次给予0.2 mL，每3 h给予1次，随后每24 h增加0.1 mL，连续喂养3 d。随机选取45只新生大鼠每天早晚人工喂养后给予缺氧+冷刺激［11］：新生鼠放入自制缺氧箱，控制N2流量为15 L·min-1，测氧仪显示O2浓度为0时开始计时，维持90 s后关闭输N2阀门，立即取出新生鼠，放置于4℃冰箱中，持续10 min，连续3 d，每天2次。以排黄绿色黏液稀便、体质量减轻为造模成功标志。10只新生大鼠仅母鼠分离、人工喂养，不作缺氧+冷刺激。

2.2 动物分组及干预取造模成功大鼠38只，采用体质量排序法随机分为4组，分为模型组9只、雷公藤多苷低剂量组9只、雷公藤多苷中剂量组10只，雷公藤多苷高剂量组10只；另10只仅母鼠分离、人工喂养的新生大鼠，设为对照组。造模结束次日，给予雷公藤多苷低剂量组、中、高剂量组新生大鼠分别灌胃9 mg·kg-1、18 mg·kg-1、27 mg·kg-1的雷公藤多苷片混悬液（灌胃前用生理盐水配制为0.1 mL的混悬液），其中雷公藤多苷剂量是按照人与大鼠体表面积换算的等效剂量［12］，对照组和模型组灌胃0.1 mL的生理盐水，每天1次，连续7 d。

2.3 标本采集末次灌胃结束后禁食12 h期间留取各组粪便样本1 g进行细菌学检查；禁食12 h后，脱颈法处死各组新生大鼠，立即剖腹取回盲部近端肠管约2 cm，PBS冲洗干净后随机分为两部分，一部分置于4%的中性甲醛中固定备用，另一部分储存于液氮中保存备用。

2.4 肠道组织病理学检查取固定于4%的中性甲醛中的肠道组织，常规石蜡包埋，制作厚度为4μm的连续切片，取切片进行脱蜡、水化步骤，进行苏木精-伊红（hematoxylin eosin，HE）染色。于光学显微镜下观察病理改变，并采用双盲法进行肠组织损伤评分［11］：肠绒毛膜及组织结构正常，记0分；黏膜下和（或）固有层轻度分离，记1分；黏膜下和（或）固有层中度分离，黏膜下和（或）固有层水肿，记2分；黏膜下和（或）固有层重度分离，黏膜下和（或）固有层水肿，局部肠绒毛膜脱落，记3分；肠绒毛膜完全脱落且伴肠坏死，记4分。每张切片随机取3个视野评分，取平均值。

2.5 肠道菌群分析取各组粪便样本，稀释液1∶10进行稀释，在无菌玻璃片上均匀涂布1 cm×1 cm区域，自然晾干后，在酒精灯上烤片固定，进行常规革兰氏染色［13］，于光学显微镜下（10×100倍）对细菌总数、革兰氏阳性（G+）杆菌、革兰氏阴性（G-）杆菌、G+球菌、G-球菌进行计数，每张切片随机取3个视野计数，取平均值。

2.6 检测肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平取储存于液氮中的肠组织50 mg，加入1 mL的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.0），剪碎后进行超声匀浆，4℃离心半径12 cm，2 500 r·min-1离心15 min，取组织上清液，采用ELISA检测肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平，按照说明书步骤进行操作，于酶标仪上检测待测样本光密度值，并根据标准曲线计算待测样本浓度。

2.7 GRP78、ATF6、CHOP蛋白相对表达量的检测取储存于液氮中的肠组织50 mg，液氮中研磨，转移至离心管，加入1 mL的组织裂解液，冰上孵育30 min，4℃预冷离心机12 000 r·min-1离心15 min，取上清液，采用BCA法测定总蛋白量。取50μg样本进行SDS-PAGE，电泳分离后，将条带转移至硝酸纤维素膜上，封闭液室温封闭2 h，均加入1∶500稀释的一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入1∶2 000稀释的二抗，室温孵育2 h，暗室中显色。应用凝胶成像系统扫描，ImageJ软件分析各条带灰度值，计算GRP78、ATF6、CHOP条带灰度值与内参GAPDH灰度值的比值。

2.8 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件分析数据，计量资料均以均数±标准差（±s）表示，多样本计量资料比较采用单因素方差分析，两两样本比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 新生大鼠一般情况对照组新生大鼠进奶量、排便、活动情况等均正常，试验期间无死亡；模型组新生大鼠出现进奶量减少、消瘦、懒动、反应迟钝、腹胀、腹泻、排黄绿色黏液稀便等情况；雷公藤多苷各剂量组上述情况均有所改善，且雷公藤多苷高剂量组改善最为明显。

3.2 肠组织病理学观察及组织损伤评分比较对照组大鼠肠黏膜上皮连续、完整，结构正常；模型组绒毛水肿、脱落、结构消失，固有层及黏膜下层大量炎性细胞浸润；雷公藤多苷各剂量组绒毛水肿、脱落现象减轻，结构趋于正常，炎性细胞浸润量减少，雷公藤多苷高剂量组上述病变最轻，但仍有少量炎性细胞浸润。对照组、模型组和雷公藤多苷低、中、高剂量组肠组织损伤评分分别为（0.41±0.08）分、（3.20±0.62）分、（2.51±0.42）分、（2.15±0.34）分、（1.67±0.21）分，与对照组比较，模型组肠组织损伤评分均升高（t＝14.145，P＜0.001）；与模型组比较，雷公藤多苷低、中及高剂量组肠组织损伤评分均降低（t＝2.764、5.087、7.368，P＝0.014、＜0.001、＜0.001）；与雷公藤多苷低剂量组比较，雷公藤多苷中、高剂量组肠组织损伤评分均降低（t＝2.636、5.606，P＝0.017、＜0.001），且雷公藤多苷高剂量组低于中剂量组（t＝3.007，P＝0.008）。见图1。

3.3 肠杆菌总数、肠球菌总数及杆／球菌比值比较与对照组比较，模型组肠杆菌总数、杆／球菌比值降低，肠球菌总数明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，雷公藤多苷低、中、高剂量组肠杆菌总数、杆／球菌比值升高，肠球菌总数明显降低（P＜0.05）；与雷公藤多苷低剂量组比较，雷公藤多苷中、高剂量组肠杆菌总数、杆／球菌比值升高，肠球菌总数明显降低（P＜0.05）；与雷公藤多苷中剂量组比较，雷公藤多苷高剂量组肠杆菌总数、杆／球菌比值升高，肠球菌总数降低（P＜0.05）。见表1。

图1 肠组织病理学观察（HE，×200）

表1 肠杆菌总数、肠球菌总数及杆／球菌比值比较 （±s）

表1 肠杆菌总数、肠球菌总数及杆／球菌比值比较 （±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05；与雷公藤多苷低剂量组比较，△P＜0.05；与雷公藤多苷中剂量组比较，▲P＜0.05

组别n 肠杆菌总数／个 肠球菌总数／个 杆／球菌比值对照组10 181.59±17.36 65.70±7.31 2.76±0.24 模型组9 110.44±9.58*205.38±19.88*0.54±0.08*雷公藤多苷低剂量组 9 125.27±13.07＃ 180.01±19.20＃0.70±0.09＃雷公藤多苷中剂量组 10 141.08±14.22＃△ 158.36±17.35＃△0.89±0.11＃△雷公藤多苷高剂量组 10 156.31±15.94＃△▲122.47±15.32＃△▲ 1.28±0.16＃△▲F值34.980 106.974 346.237 P值＜0.001＜0.001＜0.001

3.4 肠道G+杆菌、G+球菌占总菌群数比率比较与对照组比较，模型组G+杆菌比率明显降低，G+球菌比率明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，雷公藤多苷低、中、高剂量组G+杆菌比率明显升高，G+球菌比率明显降低（P＜0.05）；与雷公藤多苷低剂量组比较，雷公藤多苷中、高剂量组G+杆菌比率明显升高，G+球菌比率明显降低（P＜0.05）；与雷公藤多苷中剂量组比较，雷公藤多苷高剂量组G+杆菌比率明显升高，G+球菌比率明显降低（P＜0.05）。见表2。

3.5 肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较与对照组比较，模型组IL-6水平明显降低，IL-1β、TNF-α明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，雷公藤多苷低、中、高剂量组IL-6水平明显升高，IL-1β、TNF-α明显降低（P＜0.05）；与雷公藤多苷低剂量组比较，雷公藤多苷中、高剂量组IL-6水平明显升高，IL-1β、TNF-α明显降低（P＜0.05）；与雷公藤多苷中剂量组比较，雷公藤多苷高剂量组IL-6水平明显升高，IL-1β、TNF-α明显降低（P＜0.05）。见表3。

表2 肠道G+杆菌、G+球菌占总菌群数比率比较 （±s，%）

表2 肠道G+杆菌、G+球菌占总菌群数比率比较 （±s，%）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05；与雷公藤多苷低剂量组比较，△P＜0.05；与雷公藤多苷中剂量组比较，▲P＜0.05

组别n G+杆菌比率G+球菌比率对照组10 60.54±5.97 19.36±2.07模型组9 29.88±3.51*51.20±5.22*雷公藤多苷低剂量组 9 35.30±4.10＃44.54±4.35＃雷公藤多苷中剂量组10 41.26±5.11＃△36.83±3.16＃△雷公藤多苷高剂量组10 49.55±5.24＃△▲30.17±3.22＃△▲F值58.023 106.410 P值＜0.001＜0.001

表3 肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较 （±s，ng·L-1）

表3 肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较 （±s，ng·L-1）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05；与雷公藤多苷低剂量组比较，△P＜0.05；与雷公藤多苷中剂量组比较，▲P＜0.05

组别n IL-1βIL-6 TNF-α对照组10 52.33±7.21 105.91±8.30 26.15±6.77 模型组9 262.07±20.66*26.32±3.11*315.49±21.83*雷公藤多苷低剂量组9 201.54±18.73＃51.64±6.54＃231.02±20.26＃雷公藤多苷中剂量组 10 168.78±15.21＃△60.27±6.34＃△175.10±19.37＃△雷公藤多苷高剂量组 10 131.19±15.09＃△▲72.33±6.75＃△▲94.37±10.22＃△▲F值232.762 193.150 442.447 P值＜0.001＜0.001＜0.001

3.6 肠组织中GRP78、ATF6、CHOP蛋白相对表达量比较与对照组比较，模型组GRP78、ATF6、CHOP蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，雷公藤多苷低、中、高剂量组GRP78、ATF6、CHOP蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05）；与雷公藤多苷低剂量组比较，雷公藤多苷中、高剂量组GRP78、ATF6、CHOP蛋白相对表达量均降低（P＜0.05），且雷公藤多苷中剂量组低于高剂量组。见表4，图2。

表4 肠组织中GRP78、ATF6、CHOP蛋白相对表达量比较 （±s）

表4 肠组织中GRP78、ATF6、CHOP蛋白相对表达量比较 （±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05；与雷公藤多苷低剂量组比较，△P＜0.05；与雷公藤多苷中剂量组比较，▲P＜0.05

GRP78 ATF6 CHOP对照组组别n 10 0.41±0.06 0.38±0.04 0.14±0.03 模型组9 2.06±0.18*1.49±0.12*1.35±0.16*雷公藤多苷低剂量组 9 1.11±0.11＃1.10±0.11＃1.13±0.12＃雷公藤多苷中剂量组 10 0.85±0.09＃△0.83±0.08＃△0.92±0.08＃△雷公藤多苷高剂量组 10 0.62±0.07＃△▲0.60±0.07＃△▲ 0.65±0.09＃△▲F值326.753 231.944 197.043 P值 ＜0.001＜0.001＜0.001

图2 肠组织中GRP78、ATF6、CHOP蛋白表达

4 讨论

NEC是新生儿危重症，多在出生后3周内发病，以肠道局部坏死为临床特征，易导致肠穿孔［14］。外科手术结合常规对症治疗是主要干预手段，但治疗效果仍需进一步提高［15-16］。目前NEC发病机制尚未完全阐明，认为与早产、人工喂养、肠道菌群紊乱等多种因素有关，阐明NEC发病机制并寻找有效治疗方法有重要意义［17-18］。雷公藤多苷是中药雷公藤的有效活性成分，可通过调节体液免疫、细胞免疫参与机体炎症反应［19］。研究雷公藤多苷对NEC新生大鼠的干预效果及作用机制，可为雷公藤多苷进一步应用于临床提供依据。

临床中手术切除的新生儿肠道组织标本，因伴有严重坏死及非特异性炎症病变，不适合对疾病早期病变的研究［20］。人工喂养联合缺氧冷刺激复制NEC模型，其肠道损伤病理改变过程与人类相似［21］，本研究应用该方法建立NEC新生大鼠模型。结果显示造模大鼠出现腹胀、腹泻、排黄绿色黏液稀便等NEC典型症状，肠道病理改变与临床相似。机体肠道菌群多种多样，如双歧杆菌属、乳杆菌属等G+杆菌等生理性优势菌群，肠球菌、链球菌等G+球菌及拟杆菌、大肠埃希菌等G-杆菌，属条件致病菌，另外葡萄球菌、假单胞菌等多属于G-杆菌和G+球菌，属有害病原菌［22-23］。胎儿肠道无菌，新生儿在出生数小时内肠道细菌迅速定植和生长，达到平衡状态，使杆球菌比值维持在3左右，喂养方式、缺氧、寒冷等刺激因素均可引起肠道菌群定植紊乱［24］。本研究中模型组肠道杆球菌比值约0.54，优势菌群G+杆菌比率降低、条件致病菌或病原菌G+球菌比率升高，应用不同剂量雷公藤干预后杆球菌比值、G+杆菌比率均得到显著提高，G+球菌比率降低，提示NEC新生大鼠的肠道菌群紊乱现象得到纠正。此外，本研究应用不同剂量雷公藤多苷干预后，各干预组较模型组肠组织损伤评分、肠组织IL-1β、TNF-α水平呈剂量依赖性降低，而肠组织IL-6水平呈剂量依赖性升高，说明雷公藤多苷有助于调节NEC新生大鼠的肠道炎症反应。研究显示，肠道菌群紊乱后，条件致病菌及病原菌产生的毒素可引起黏膜完整性破坏、炎症细胞浸润等一系列病理改变，肠道发生严重炎症病变［25］。艾燕等［26］研究表明，雷公藤多苷可通过抑制肠组织中TNF-α等促炎因子水平发挥治疗溃疡性结肠炎大鼠炎症反应作用；钦丹萍等［27］研究显示，雷公藤多苷可有效缓解克罗恩病、溃疡性结肠炎患者肠道炎症反应，与本研究结果相似。NEC发病后肠黏膜完整性被破坏，病原菌异位，引起内源性促炎介质大量释放，雷公藤通过抑制促炎介质释放，促进抗炎介质分泌，发挥保护肠黏膜完整性作用。

本研究中，雷公藤多苷各剂量组肠组织中GRP78、ATF6、CHOP蛋白相对表达量呈剂量依赖性降低，说明雷公藤多苷可能通过抑制GRP78-ATF6-CHOP通路发挥调控作用。GRP78是主要分布于内质网中的热休克蛋白，参与内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ESR）稳态调节［28］。生理状态下，GRP78与下游ATF6结合处于非激活状态，当ESR启动后，两者发生解离，ATF6随之活化进入细胞核，激活位于下游的靶基因CHOP转录和翻译，启动细胞凋亡等过程［29］。喂养不当、缺氧等多种高危因素作用下，肠道ESR增加，GRP78-ATF6-CHOP通路激活，从而启动细胞凋亡通路，加之肠道微生态失衡释放大量肠毒素，进一步加剧肠道上皮细胞凋亡，促进肠组织损伤［30］。由此可知，雷公藤多苷可能通过抑制GRP78-ATF6-CHOP通路，缓解肠组织上皮细胞凋亡现象，从而发挥保护NEC肠组织作用。

综上所述，雷公藤多苷可有效改善NEC新生大鼠的肠道菌群紊乱现象，且可能通过抑制GRP78-ATF6-CHOP通路发挥保护肠组织的作用，为临床雷公藤多苷用于NEC的防治提供理论参考。