碳氮比对泰乐菌素发酵的影响

杨光耀，田平雅，吕苗苗，牛 春

（宁夏泰瑞制药股份有限公司，宁夏 银川 750000）

泰乐菌素（tylosin,Tyl）是一类十六元大环内酯类兽用抗生素，其抗菌谱广，在应对G+菌感染以及畜牧增产方面有巨大作用，应用于兽药及饲料添加剂。目前，在工业生产中，弗氏链霉菌（Streptomyces fradie）是泰乐菌素的主要生产菌[1-3]，泰乐菌素对G+菌及某些G-菌（如金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、肺炎双球菌等）有效，对螺旋体与支原体有特效。它不仅对鸡的败血症、猪的流行性肺炎和赤病及小牛支原体引起的肺炎有很好的疗效，而且对畜、禽的生长有明显的促进作用，被广泛地用于畜禽生产及兽医治疗，市场需求量极大[4,5]。

发酵过程中影响泰乐菌素效价的因素众多，主要包括原料的碳氮比和培养基的pH 等。原料碳氮比对发酵过程中产物的积累有非常大的影响，李鑫[6]等人发现在产物积累阶段，较高的碳氮比可有效地抑制副产物的形成而促进目标产物的积累，利于目标产物效价的提高。发酵液的 pH 值是微生物代谢的综合效果，对菌体的生长和产物的合成具有很大影响，当碳源不足时，有机氮源作为碳源利用，则 pH 会上升，氮代谢过程中氨基酸中的-NH2被利用后 pH 会下降。因此，可以尝试通过控制发酵液中碳源和氮源的含量间接控制发酵液的 pH，从而提高泰乐菌素的效价。本文主要通过控制泰乐菌素发酵过程中发酵液的碳氮比，研究发酵过程中碳氮比对 pH 和泰乐菌素效价的影响，为泰乐菌素发酵提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试菌株 弗氏链霉菌，保藏自宁夏泰瑞制药股份有限公司。

1.1.2 实验培养基 实验中所用培养基类型及配方见表1。

1.1.3 主要实验仪器 实验中所用的主要仪器见表2。

表1 实验培养基配方

表2 试验主要仪器清单

1.2 实验方法

1.2.1 泰乐菌素的发酵过程斜面培养：用接种铲刮取两铲孢子接种于 5ml 无菌水（加入 玻璃珠）于 37℃，150 r/min 培养 30 min。过滤，收集滤液。9 000 转/min 离心 5 min，弃去大部分上清液，用剩余的液体（1 ml 左右）悬浮菌体，制成孢子悬浮液，涂布于试管斜面，32℃培养 8～12 d。摇瓶种子液的制备：在净化工作台上铲取斜面4～8 cm2接种于 750 ml 三角摇瓶中，于温度 28～30℃、湿度30%～50%、摇床转速 200～250 r/min 的条件下培养 40～48 h。

一级种子培养：将培养好的摇瓶种子液用火焰接种法接种于一级种子罐，接种量200 ml。工艺控制参数：罐温30.0±0.2℃，罐压0.06±0.002 MPa，空气流量0.20～0.70 m3/h，搅拌转速150～450 r/min，DO≥45%。

二级种子培养：将培养好的一级种子液用压差法移种于二级种子罐，移种量10%。工艺控制参数：罐温29.0±0.2℃，罐压0.06±0.002MPa，空气流量0.5～1.5 m3/h，搅拌转速 200～600 r/min，DO≥45%。

发酵培养：以原始发酵培养基为基础，保持碳源（玉米粉）含量不变，氮源（黄豆饼粉）含量分别按照0.5%、5%、10%、15%、20%配制培养基，其他成分及其含量保持不变，于10 L 发酵罐中恒温发酵 7 d，测发酵液效价及发酵过程中pH 的变化趋势。以原始发酵培养基作为对照组。将培养好的二级种子液用压差法移种于碳氮比不同的发酵罐，移种量10%，工艺控制参数：罐温29.0±0.2℃ 罐压0.06±0.002 MPa，空气流量2.0～2.8 m3/h，搅拌转速 200～650 r/min，DO≥45%。

1.2.2 泰乐菌素效价测定

1.2.2.1 标准曲线制备 称取泰乐菌素标准品，用去离子水配制对照品溶液100 ml（浓度为1 000 u/ml），吸取对照液7.0 ml、6.0 ml、5.0 ml、4.0 ml、3.0 ml到10 ml容量瓶中用纯化水定容至刻度，摇匀。再分别精密吸取1.0 ml到25 ml容量瓶中用0.1 mol/L盐酸溶液定容至刻度，摇匀，以0.1 mol/L HCl 为参比，在290 nm处测其吸光值。以吸光值为横坐标，浓度为纵坐标绘制曲线，如图1所示，曲线方程为y=42.577x+0.6621，其中R2=0.9961。

图1 泰乐菌素标准曲线测定图

1.2.2.2 发酵液泰乐菌素效价测定 取 50 ml 发酵液，加入2ml 20% Al2(SO4)3溶液进行絮凝，过滤；取过滤液，根据预估效价对滤液进行适当稀释；吸取 1 ml 稀释液于 25 ml 容量瓶内，加入 0.1 mol/L HCl 定容，往复颠倒混匀，290 nm 下测 吸光值（0.1 mol/L HCl 为参比），根据标准曲线表结合稀释倍数计算发酵液中泰乐菌素含量。

1.2.3 发酵过程的pH测定 发酵过程中全程使用pH电极在线检测pH值。

2 结果

2.1 氮源浓度对效价的影响

碳氮比对微生物的生长及代谢产物形成具有直接的影响，通过处理数据，作图分析，如图 2所示，发酵时间达到 149 h时，氮源浓度分别为10%、15%和 20%的培养基效价出现最高值，在166 h 效价出现下降的趋势；而 0.5%和 5%以及 CK 组在166 h 效价处于最高值。其中，氮源含量为 5%的发酵液的效价较其他浓度显著增高，与对照组相比提高了11.2%。

图2 碳氮比对效价的影响图

2.2 C/N 对 pH 的影响

发酵过程中各培养基的 pH 的变化如图 3 所示，30 h 后 pH 在 34 h 和 36 h 时分别出现了峰值，此后pH呈现下降的趋势，且随着黄豆饼粉的含量的增加，pH峰值则依次增加。结合效价最高时培养基中黄豆饼粉的含量（5%），pH峰值出现在35 h，此时的 pH 值为 7.25。造成 pH 值出现峰值的原因与菌体自身的生长繁殖和代谢活动密不可分，发酵后期，随着碳源的消耗殆尽，菌体继续以氮源中的 C 作为自身生长所需的碳源，使发酵液中的含量增高，从而导致发酵液的pH值出现短暂的升高；30 h后菌体已经开始大量形成代谢产物，参与菌体代谢产物的形成，因此出现了后期 pH 值下降的现象。

图3 pH 比对效价的影响

3 讨论

培养基的碳氮比对微生物生长及其产物的形成具有非常重要的影响。过量的氮源会促进菌体的生长，发酵液pH偏高，不利于代谢产物的积累；而培养基中缺乏氮源则会降低菌体的繁殖量同样影响产物的形成。碳源过量会导致发酵液 pH偏低，不利于菌体的生长繁殖；当培养基中缺乏碳源时，会引起菌体衰老和自溶。因此，适合的碳氮比对工业微生物的生长繁殖与产物形成具有重要的意义。

郝勃等[10]对筛选的高产泰乐菌素的弗氏链霉菌S1-1的培养基通过正交实验得到了新的发酵配方，结果效价比原发酵配方提高了10.83%～16.53%，田宇[11]通过BP神经网络结合遗传算法对其筛选的高产菌株进行了培养基优化，结果表明优化后的培养基较其采用正交优化的培养基提高了18.3%。通过以上可以看出，泰乐菌素发酵生产中不同碳源和氮源对泰乐菌素的效价影响较大，这与本实验的结果相符，以原始发酵培养基为基础，保持碳源（玉米粉）含量和其他成分及含量不变，改变氮源（黄豆饼粉）加入量，形成不同的C/N比，对比pH变化及效价高低，明确了在碳源保持不变的情况下，培养基中氮源的加量。

4 结论

本文通过改变氮源的含量控制发酵培养基的碳氮比，检测发酵过程中pH的变化及发酵液效价，研究结果表明，以原始发酵培养基作为对照组，发酵培养基中添加 5%的黄豆饼粉更有利于工业微生物形成代谢产物，提高发酵液效价。