基于线粒体Cytb基因探讨大尾羊与国内外绵羊品种的系统发生关系

陈天莹，胡 峻，李孟纯，乔自林，李 铀，2*

（1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730100；2.西北民族大学 生物医学研究中心/甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃 兰州 730030；3.西北民族大学 生物医学研究中心 生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030）

绵羊是世界上最早驯化的一批畜种。我国绵羊品种种类繁多。世界上不同生产方向的绵羊品种和类型有700多个，其中大部分是用来生产毛与肉[1]。就绵羊的分布而言，其在世界各地均有分布，并且不同国家地区通过杂交育种等方式培养了一系列新型品种，比如，法国国立农业科学研究院曾致力于培育新的基因型品种罗曼诺夫羊×白里松羊，新培育的基因型品种与纯血统的母本品种相比，每只母羊产羔数增加了65%[2]。法国还利用“拉康”羊与东弗里生羊和沙尔金羊进行多品种杂交，所培育的新品种继承了东弗里生产奶量高，沙尔金羊易挤奶、对当地条件适应性强的优点[2]。早在20世纪70年代，西德北威斯特伐利亚就引进了兰头门羊并与代克塞、东弗里生和德国黑头羊等品种进行杂交，培育出的新品种具有产羔率高，早熟，肉品质好的特点[2]。

我国绵羊品种种类繁多，结合各地区的气温以及地形等因素，可将我国绵羊分布划分为多个区域，由沿海区的寒羊、湖羊，到云贵高原区的小尾寒羊，再到北疆区的哈萨克羊、当巴什羊[3]。地域的差异造就了绵羊品种的不同，并且通过杂交培育出了藏系绵羊，它适应高寒牧区恶劣的自然环境，耐粗放的饲养管理条件，具有产肉性能良好、毛纤维长、光泽良好等优点。

但由于长期进行杂交，新的经济价值高的品种不断形成导致世界各国生产性能低的古老地方品种和培育品种，趋于减少，濒于消失甚至泯灭，并引发世界性的畜禽品种资源危机[4]，绵羊资源的保护迫在眉睫。目前已出现利用地方品种来改造培育品种达到对该物种保护的目的，如在澳大利亚，有学者提出，由非洲国家引入无毛羊给澳洲美利奴羊导入一次血液，在保留澳洲美利奴羊现有价值的特性不变情况下，提高其耐苦性和适应性，使澳洲美利奴羊在干旱地区得到发展[5]。我国的洼地绵羊则采取了建立洼地绵羊纯种保护区，育种核心群、冻精冻胚保种基因库、纯种繁育体系等方式[6]，对该物种进行有效的保护。

在我国甘肃省分布有藏羊、大尾羊与小尾羊等品种。其中兰州大尾羊（Lanzhou fat tailed sheep）是我国特有的绵羊地方品种，但同时也是一个濒临灭绝的畜种，研究结果表明，其灭绝频率为0.77，为北方11个绵羊品种之首，品种贡献率为10.52%，居于第三，保护潜力为0.141 9，居第1位。因此，保护兰州大尾羊这一珍贵的地方绵羊品种迫在眉睫[7]。

线粒体DNA（mtDNA）是动物体内唯一长期、稳定存在的核外基因组，其在世代间没有基因重组，呈现严格母系遗传，mtDNA在细胞内以多拷贝形式存在，平均可达数百个拷贝，肝脏细胞可达数千个拷贝。因此，动物线粒体基因影响广泛，同时具有高突变率等特点，其突变速率为单拷贝核DNA的5～10倍，被广泛用于动物起源进化、物种鉴定、疾病诊断、衰老及动物经济性状的核外基因效应研究[8]。目前我国的苏蕊、杨钟[9]等已有对内蒙古绒山羊线粒体基因组序列测定以用来的起源、进化、不同类群的分化以及特定遗传特性形成机制。陈晓勇等则对小尾寒羊线粒体基因组遗传变异分析进行了探索与研究并为mtDNA多态性与经济性状关联分析及核外遗传效应研究提供分子生物学基础[8]。故可通过对这一类DNA变异的研究来探讨群体间的亲缘关系。而一般观点认为家绵羊可能的祖先是亚洲和欧洲的摩弗伦羊（Ovismusimon）羱羊（Capraibex）阿卡尔羊（Ovisorientalis）等几个野生绵羊种[10]。张丽娟[11]等的研究认为绵羊最初的驯化地只可能在亚洲，并且中国绵羊至少具有两种不同的母系起源。

本研究对甘肃地区的大尾羊绵羊品种的线粒体Cytb基因（Cytochrome b gene）进行扩增，将得到的扩增序列与在GenBank上下载的国内外其他绵羊品种的Cytb基因的扩增序列进行进化树分析，探讨种群之间的系统发生关系，对研究甘肃地区的绵羊品种起源以及对绵羊品种的保护和利用有着一定的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

甘肃永靖某羊场采集大尾羊耳缘肌肉组织样本（n=6，DL1-DL6）。样本置于1∶1配比的100%乙醇与生理盐水组织保存液中待后续使用。

1.2 基因组扩增

使用Gentra Puregene extraction kit（Gentra Systems Inc.）从动物组织中提取高纯度、高分子量的基因组DNA。并参照已发表的绵羊cytb基因序列设计引物，由宝生物工程（大连）公司合成。引物序列、退火温度及产物大小见表1。

取上、下游引物各0.5 ul，浓度为（10 mM）；DNA样品（50 ng/ul）2 ul，并添加PremixTaq（Takara）的量为12.5 ul，浓度为5U/ul；最后补加9.5 ul的无菌水，得到最终的25 ul的反应体系。

表1 引物信息

将制备的反应体系置于PCR仪器中进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，54℃退火45 s，72℃延伸1 min，循环35次；最后72℃延伸10 min，最后将扩增产物进行1.4%琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像仪上检测。

1.3 数据处理及进化树的建立

将大尾羊的PCR扩增产物送至天启基因生物科技有限公司（甘肃兰州）进行测序，使用Geneious11.0.4处理测序所得原始AB1文件，人工校对后得到样品序列，并从GenBank上下载国内外绵羊品种的cytb基因序列见表2（n=22），使用Geneious11.0.4比对并处理序列。

使用MEGA-X建立进化树前先进行遗传距离算法模型分析，在MODEL中使用Find Best DNA/Protein Models（ML）来选择在建立ML树时应选择的遗传距离算法模型。

建立进化树时，选择盘羊Ovisammon作为外群。使用MEGA-X中的最大似然法（Maximum Likelihood，ML）构建ML树；邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建NJ树。ML树参数为1 000次Bootstrap重复，模型分析中所得最佳的方法计算遗传距离；NJ树参数为1 000次Bootstrap重复，p-distance法计算遗传距离。

表2 从GenBank上下载的国内外绵羊品种的cytb基因序列

图1 遗传距离算法模型计算结果

2 结果

将实验所得结果交由公司测序，各个样品最终序列大小均在900～1 020 bp之间，经Geneious11.0.4人工校对并与国内外cytb基因序列比对处理后大小为964 bp。

在遗传距离算法模型分析中，具有最低BIC分数（贝叶斯信息标准）的模型被认为是描述替换模式的最佳模型。对于每个模型，还给出了AICC值（Akaike信息准则，修正）最大似然值（LNL）和参数数量（包括分支长度）。

为了估计ML值，自动计算了树形拓扑。这项分析涉及31个核苷酸序列，数据集中共有964个职位，最终由所得图1中可以得出，最低BIC分数的模型为HKY模型。

利用ML法及NJ法，经过Bootstrap自举检验1 000次可得如图2、图3两个进化树，其中盘羊是选取的外群，这两种建树方法能够较好地区分外群，并且两种建树方法所得ML树与NJ树的结构基本相似。

图2 基于线粒体Cytb基因构建的NJ树

如图2所示，从构建的NJ树中可以看出样本DL4、DL5距离近，与乌拉藏羊、乌拉黑羊、吐鲁番黑羊、叶城羊、察库尔干羊等10个品种聚为一支，它们的亲缘关系较为密切；样本DL1、DL2距离近，与萨赫勒羊、贾伦克羊、普拉门卡羊、库伊布斯科夫羊、乌德穆尔提安羊等10个品种亲缘关系较为密切，聚为一支；样品DL3和DL6在同一分支，但两者之间仍具有一定的亲缘距离，并且相较于样本DL1、DL2、DL4、DL5及其他近缘种羊的亲缘关系较远；盘羊属于外群，与前几者的亲缘关系较远。

图3 基于线粒体Cytb基因构建的ML树

如图3所示，从构建的ML树中可以看出样本DL1、DL2距离近，与图申羊、卡拉迪羊、奥帕里诺羊、汉中羊、贾伦克羊等10个品种聚为一支，其亲缘关系较为密切；可以看出样本DL4、DL5距离近，与乌拉黑羊、乌拉藏羊、哈姆达尼羊、巴什贝羊、巴音布鲁克羊等10个品种亲缘关系较为密切，聚为一支，且样本DL1、DL2、DL4、DL5之间亲缘关系较近并与其他近缘种羊有着较为密切的关系；样品DL3和DL6在同一分支，但两者之间仍具有一定的亲缘距离，且与其他样本的亲缘关系较远；盘羊仍是明显的外群，与前几者的亲缘关系较远。

3 讨论

根据本文构建的进化树可以分析得出，样本DL1、DL2与同支上的10种羊亲缘关系密切，可能是因为这两个样本羊与这12种羊存在基因流；DL4、DL5与同支的10种羊亲缘接近也可能是类似的原因。同时，本研究中使用的样本与文献中已发表的大尾羊样本（序列号KF938335.1）并未聚在一支，表明现存大尾羊可能存在较为严重的杂交情况，为大尾羊的纯种保护提出了挑战。

值得注意的是，样品DL3和DL6在130bp、251bp、316bp、319bp、399bp、736bp、862bp这几个位点出现了单核苷酸变异，导致其与其他大尾羊样本遗传差异较大。除此以外样本DL3在619bp、658bp这两处位点也出现了单核苷酸变异而样品DL6则没有，且两者在736bp、399bp、316bp、251bp的单核苷酸变异程度并不一致，从而导致这两个样本之间产生差距。样品DL3和DL6于cytb基因上发现的单核苷酸变异，在本研究使用的其他样本中并未出现。这些变异出现的原因，以及其是否与本土其他绵羊品种存在杂交情况，仍需进一步研究。

本研究对甘肃地区的大尾羊绵羊品种的线粒体基因cytb进行扩增测序并对其基因组成进行分析，初步构建了与其他国内外羊的系统进化树，研究就基于cytb线粒体基因将甘肃地区的主要地方绵羊品种兰州大尾羊与国内外部分绵羊品种进行了比较，来探讨种群之间的系统发生关系，这对兰州大尾羊品种起源提供了理论依据，并对研究甘肃地区的绵羊品种起源以及绵羊品种的保护和利用有着一定的意义。