扎冲十三味丸干预血管内皮细胞损伤炎性反应相关因素探讨*

林 琳,张东威,塔 娜,刘 鑫,刘月英,白梦蕾,孙天洋，陶 春

(1.内蒙古民族大学医学院,内蒙古通辽 028000；2.内蒙古民族大学附属医院；3.包头医学院)

蒙成药扎冲十三味丸(又名嘎迪-13味丸)，由制草乌、诃子、麝香、禹粮土、制珊瑚、制珍珠、木香、石菖蒲、沉香、甘草、丁香、煅磁石、肉豆蔻13味单药组成，蒙医临床一直用于治疗半身不遂，神经麻痹，风湿，关节疼痛等疾病，疗效满意[1]，已收录入《中华人民共和国药典》[2]。木香和沉香的主要的化学成分均有木香内酯，木香内酯具有极强的抗炎镇痛效果。丁香在蒙医临床治疗心血管疾病中，也被认为具有抗炎、抗氧化作用[3]。本实验制备改良大鼠腹主动脉缩窄模型，通过血流动力学改变造成实验大鼠血管内皮损伤，应用扎冲十三味丸干预，探讨该药对血管内皮细胞损伤所致炎症反应干预作用的相关因素。

1 材料与方法

1.1实验动物 选用8周Sprague-Dawley(SD)健康大鼠100只，雄性，体重180～210 g，购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司(SPF级，动物编号：SCXK(吉)-2018-0007)，于内蒙古民族大学医学院动物实验室(清洁级)适应性饲养一周，标准大鼠饲料饲养，自由摄食饮水，温度23～25 ℃，湿度55 %～70 %。术前12 h禁食。

1.2试剂与仪器 扎冲十三味丸由内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室提供(批准文号：内药制字M14060747)，Elisa试剂盒购自武汉华联科生物技术有限公司。酶标仪为芬兰Labsystems Multiskan MS公司产品，仪器型号为352型。透射电子显微镜为日本日立综合跨国公司(hitachi)生产，仪器型号HT7700。

1.3方法

1.3.1分组 首先将100只SD大鼠随机选出25只为假手术组，只暴露腹主动脉，不做其他手术；其余75只进行改良腹主动脉缩窄模型手术；将手术后的实验大鼠随机分为模型组、扎冲十三味丸组、曲美他嗪组，每组25只，自由饮水摄食。

1.3.2给药 药量参考《药理实验方法学》计算方法。扎冲十三味丸以蒸馏水配制成2 %浓度，灌胃给药，每日一次，每次1.2 mL；模型组给予生理盐水灌胃；假手术组在同一环境下饲养不予灌胃。西药盐酸曲美他嗪用于心血管疾病的治疗，具有改善心肌细胞缺氧和血管内皮细胞功能作用[4]，本实验作为实验比对组。曲美他嗪按成人口服剂量6.3倍，用双蒸水稀释后灌胃。

1.3.3模型建立 建立改良腹主动脉缩窄模型。实验大鼠10 %水合氯醛(0.35 mL/100 mg)腹腔注射麻醉，大鼠右侧卧位固定于操作台上，腹左侧肋弓下缘脊柱前备皮，常规消毒，在肋脊角下纵型切开皮肤1～2 cm，钝性分离筋膜及肌肉，暴露左肾及其上方的腹主动脉，分离出腹主动脉，用4号缝合线从腹主动脉下方穿过备用，将磨钝的0.7 mm注射针头平行至于腹主动脉外侧，将针头与腹主动脉一起捆绑后，迅速小心拔出针头，造成腹主动脉部分狭窄，缝合后常规消毒，大鼠保温复苏至清醒，自由饮食饮水。扎冲十三味丸组在手术第二天开始给扎冲十三味丸组灌配置好的扎冲十三味丸药液、模型组灌生理盐水、曲美他嗪比对组灌配置好的曲美他嗪药液。共建模28天。

1.3.4标本的采集与检测 于造模28 d腹主动脉取血(麻醉同上)，剪下带有结扎线段的腹主动脉2～3cm。将腹主动脉做相应的染色观察，方法严格按照说明书进行；采用Western-blot法检测血管组织中IL-6、TNF-α蛋白的表达；Elisa法检测实验大鼠血清中IL-6、TNF-α含量及血浆中血管内皮因子NO、ET-1的含量。

2 结果

2.1通过Masson染色法观察扎冲十三味丸对大鼠血管组织纤维化程度 Masson染色法观察血管组织，胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。假手术组胶原纤维、肌纤维厚薄均匀排列正常；模型组蓝染胶原纤维增多，提示有胶原纤维化；扎冲十三味丸组血管组织蓝染面积与模型组相比减少；曲美他嗪比对组血管组织蓝染面积与扎冲十三味丸组蓝染面积相似，与模型组相比蓝染面积减少。通过Image J软件计算胶原容积分数，分析血管组织纤维化程度。假手术组胶原容积分数为7.318 %；模型组胶原容积分数高于假手术组；扎冲十三味丸组与曲美他嗪组胶原容积分数差距不大但小于模型组大于假手术组。

通过对实验大鼠血管壁组织进行Masson染色，结果显示见模型组较假手术组实验大鼠血管壁组织的蓝染胶原纤维增多，胶原容积分数增高，提示有胶原纤维化。

图1 大鼠血管组织Masson染色图

图2 各组大鼠Masson染色胶原容积分数

2.2HE染色观察扎冲十三味丸对实验大鼠血管内皮细胞炎性损伤的干预 通过HE染色法，观察血管组织炎性细胞浸润情况：假手术组实验大鼠的血管内皮细胞的排列和形态均正常、无炎性细胞浸润；模型组实验大鼠的血管组织中局部管壁结构不清，可见较多炎性细胞、多核巨细胞、中性粒细胞浸润；扎冲十三味丸组实验大鼠的血管组织局部管壁可见少量炎性细胞浸润，较模型组炎性细胞浸润数量减少；曲美他嗪组实验大鼠血管组织有炎性细胞浸润与扎冲十三味丸组相似，较模型组炎性细胞浸润数量减少。

2.3通过透射电镜观察 透射电子显微镜下观察血管超微结构的变化，可见各组血管平滑肌均存在不同程度损伤。假手术组血管平滑肌细胞有较轻微的损伤，线粒体数量较少，轻度肿胀，线粒体嵴模糊，粗面内质网未见明显扩张；模型组血管平滑肌细胞损伤较为严重，膜内脂滴较多，细胞器空泡变；扎冲十三味丸组血管平滑肌细胞损伤较模型组轻，线粒体数量较少，轻度肿胀；曲美他嗪组平滑肌细胞损伤较模型组重较扎冲十三味丸组轻，内质网可见明显扩张。

图3 大鼠血管组织HE染色

图4 大鼠透射电镜图×60K

2.4通过 ELISA法观察扎冲十三味丸对大鼠血管内皮功能的影响 通过 ELISA法检测实验大鼠血清中IL-6和TNF-α的含量。与假手术组相比较，模型组中IL-6和TNF-α的含量增加，差异具有统计学意义(P<0.05)；扎冲十三味丸组、曲美他嗪组IL-6和TNF-α的含量增加，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比较，扎冲十三味丸组、曲美他嗪组IL-6和TNF-α的含量降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

通过ELISA法检测实验大鼠血浆NO和ET-1含量，观察血管的舒张收缩状态。与假手术组相比，模型组中NO和ET-1的含量均显著增加(P<0.05)；扎冲十三味丸组较模型组NO和ET-1的含量降低，差异显著(P<0.05)；曲美他嗪组较模型组NO和ET-1的含量降低，差异显著(P<0.05)；曲美他嗪组较扎冲十三味丸组差异不明显(P>0.05)。

表1 各组大鼠血清IL-6、TNF-α含量比较

表2 各组大鼠血浆中NO、ET-1含量比较

2.5计算各组大鼠血浆中NO/ET-1比值 内皮细胞依赖性血管舒张收缩功能ET-1/NO系统，是评价内皮功能的重要标准。模型组NO和ET-1含量较假手术组均增高，且NO/ET-1比值(1.025)高于假手术组(0.628)；扎冲十三味丸组NO和ET-1含量均高于假手术组而低于模型组，NO/ET-1比值(1.001)。扎冲十三味丸可以降低血浆中NO和ET-1含量，对模型组血管的紧张度无改变影响；曲美他嗪组，NO/ET-1比值下降，为0.704，较模型组小，较假手术组高，较扎冲十三味丸组小。见表3、图5。

表3 各组大鼠血浆中NO/ET-1比值比较

图5 各组大鼠血浆中NO/ET-1比值比较

2.6通过免疫印迹法观察 通过免疫印迹法检测实验大鼠血管组织中IL-6和TNF-α蛋白的表达。大鼠血管组织中IL-6蛋白表达：模型组较假手术组表达显著增加(P<0.05)；扎冲十三味丸组、曲美他嗪比对组较模型组表达显著降低(P<0.05)。大鼠血管组织中TNF-α蛋白表达：模型组较假手术组表达显著增加(P<0.05)；扎冲十三味丸组、曲美他嗪组较模型组表达显著降低(P<0.05)。见图6、表4。

图6 大鼠血管组织中IL-6和TNF-α蛋白的表达

表4 大鼠血管组织中IL-6和TNF-α蛋白的表达

3 讨论

血管缩窄，血流动力学会发生改变，致使血管内皮细胞损伤引起炎性反应的发生，炎性细胞因子TNF-α不但促使炎性细胞聚集和炎症介质的释放及诱导炎性细胞因子IL-6的分泌，也可影响内皮舒张因子NO的合成和生物利用率，导致血管内皮细胞功能紊乱，血管内皮细胞损伤和血栓的形成等一系列病理生理过程[5]。IL-6由单核细胞分泌，在炎症反应中，使血管通透性增加及血管内皮细胞损伤加重并破坏其完整性和使其功能障碍。内皮细胞依赖性血管舒张功能NO/ET-1系统失衡，将引发血管内皮机能失衡，由此造成诸如血栓、斑块的产生等[6]。

本实验应用改良腹主动脉缩窄模型，通过血流动力学改变致实验大鼠血管内皮细胞损伤，而后给予相应的药物干预。结果显示，扎冲十三味丸干预血管内皮细胞损伤炎性反应，使管壁组织中炎性细胞减少，线粒体肿胀减轻，粗面内质网扩张程度减少，此作用与改善血管组织纤维化程度、降低血管组织中IL-6和TNF-α蛋白的表达、减少血清中炎性细胞因子IL-6和TNF-α的含量因素相关，且优于西药曲美他嗪，而与内皮细胞依赖性血管舒张功能NO/ET-1系统平衡无关。西药曲美他嗪有调节内皮细胞依赖性血管舒张功能NO/ET-1系统平衡的作用。

蒙成药扎冲十三味丸对心脑血管和神经系统疾病都有一定的疗效，但其在其他疾病治疗中的应用仍不明确。扎冲十三味丸具有舒筋活血、镇静止痛、扩张微血管、抑制血小板凝集、保护血管内皮细胞等作用，其作用机制尚有待进一步从临床、病理和分子角度进行深入研究，从而不断拓展其临床适应证，为人类健康服务。