人参皂苷Rb1对H2O2诱导PC12细胞损伤的保护作用*

郝广煜，方 刚，代玉晶，李 娟，侯瑞丽，贾建新，杨占君，霍东升

(包头医学院，内蒙古 包头 014040)

人参属植物具有重大的药用价值，人参(Panax ginseng Meyer)和三七(P. notoginseng (Burk) F. H. Chen)都是人参属植物中的药材。人参皂苷Rb1是从人参提取出的最丰富的生物活性形式，具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等生物活性[1]。研究证实，神经退行性疾病的发生与机体的氧化产物水平增加有着密切的关系。脑内含有大量的脂质且耗氧量较高，活性氧(reactive oxygen species, ROS)蓄积引起的损伤可能是疾病发生发展的重要原因之一[2]。因此，延缓神经退行性疾病的有效治疗方法之一可能就是通过抗氧化剂清除过量的ROS。H2O2属于活性氧自由基，为主要的ROS之一，是引起氧化应激的一个中介物。PC12细胞来源于褐家鼠肾上腺嗜铬细胞瘤，在体外培养时与神经元生长特征相似，广泛应用于研究神经细胞的功能、分化和死亡领域。赵立理等研究发现H2O2可引起PC12细胞氧化应激损伤，细胞活力下降[3]。帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种常见的老年神经系统退行性疾病，致病过程复杂，氧化应激是其众多致病因素之一。本实验采用H2O2构建PC12细胞损伤模型，通过检测细胞活性，探讨人参皂苷Rb1对H2O2诱导PC12细胞损伤模型的影响，为人参皂苷在PD方面的治疗研究提供理论参考依据，同时也为中药材资源的开发与利用积累资料。

1 材料与方法

1.1实验材料 PC12大鼠嗜铬瘤细胞株购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。人参皂苷Rb1购自上海同田生物技术有限公司。DMEM高糖培养基、马血清为美国Gibco公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；RNAiso plus、PrimeScript反转录试剂盒和SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 均购自TaKaRa大连公司；引物HO-1和GCLC由生工生物工程(上海)有限公司合成；DMSO和青霉素、链霉素购自海克隆生物化学制品(北京)有限公司)；噻唑蓝(MTT)购自sigma公司；30 %过氧化氢(H2O2)购自天津富宇试剂有限公司。

1.2实验方法

1.2.1PC12细胞培养 PC12细胞用含5 %胎牛血清、5 %马血清、100 mg/L青霉素，100 mg/L链霉素的DMEM培养液于37 ℃、5 % CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞用于后续实验。

1.2.2人参皂苷Rb1对PC12细胞增殖的影响 细胞按1×105个/mL接种于96孔细胞培养板中，每孔加100 μL，37 ℃、5 % CO2条件下孵育12 h后，分别加入系列浓度(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL) 的人参皂苷Rb1。同时设空白对照组(未加人参皂苷Rb1)，每组设置3个平行孔。培养24 h后，每孔加入新配制的5 mg/mL MTT溶液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，终止培养。吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min后，用酶标仪测量各孔的吸光度值(OD 570 nm)。根据公式：细胞存活率=[(药物孔OD值-本底对照孔OD值) /(对照细胞孔OD值-本底对照孔OD值)]×100 %计算细胞存活率。

1.2.3人参皂苷Rb1对H2O2诱导PC12细胞氧化损伤的保护作用 取对数期PC12 细胞，浓度调整为1×105个/mL并接种于96孔细胞培养板，每孔加100 μL，37 ℃、5 % CO2条件下孵育12 h后，弃去原培养液，将PC12细胞分为对照组、模型组和实验组。实验组加入系列浓度的人参皂苷Rb1(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL)溶液，模型组和对照组加入DMEM完全培养基，终体积为100 μL/孔，预处理12 h。待处理结束后，模型组和实验组直接加入H2O2溶液，终浓度为400 μmol/L，对照组加入等体积DMEM完全培养基。每组设置5个平行孔。培养24 h后，每孔加入新配制的5 mg/mL MTT溶液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，终止培养。吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min后，用酶标仪测量各孔的吸光度值(OD 570 nm)并计算细胞存活率。

1.2.4HO-1和GCLC基因的转录水平分析 按上述方法培养细胞，1 000 r/min离心10 min收集细胞，重悬于1 mL RNAiso plus中提取总RNA。以0.5 μg RNA为模板按 PrimeScript反转录试剂盒说明书反转录为cDNA。扩增引物：HO-1 forward (5'-GCCTGCTAGCCTGGTTCAAG-3') 和HO-1 reverse (5'-AGCGGTGTCTGGGATGAACTA-3')[4]；GCLC forward (5'-GTCCTCAGGTGACATTCCAAGC-3') 和GCLC reverse (5'-TGTTCTTCAGGGGCTCCAGTC-3') ；GAPDH forward (5'-AAGCTGGTCATCAACGGGAAAC-3') 和GAPDH reverse (5'-GAAGACGCCAGTAGACTCCACG-3') ，反应体系按照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ反应液配制说明配制。检测样品做3个重复，且至少3次独立重复实验。扩增程序为：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，40个循环。数据分析通过待测基因与内参基因Ct值的差值来计算基因表达差异，即基因表达水平变化倍数= 2-[(干预后待测基因-干预后参照基因)-(干预前待测基因-干预前参照基因)]。

2 结果

2.1人参皂苷Rb1对PC12细胞增殖的影响 采用MTT法检测人参皂苷Rb1对PC12细胞增殖活性的影响。结果显示，与空白组比较，人参皂苷Rb1系列浓度(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL)对PC12细胞的增殖作用无显著性差异(P>0.05)。实验结果表明，在实验浓度范围内人参皂苷Rb1对细胞增殖无影响，无细胞毒性作用(图1)。

2.2人参皂苷Rb1对H2O2诱导PC12细胞氧化损伤的影响 MTT法检测细胞存活率如图2所示，与正常对照组比较，模型组显著地降低PC12细胞存活率(P<0.001)；与模型组比较，实验组不同浓度人参皂苷Rb1(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL)培养24 h后细胞的存活率升高，且呈剂量依赖性增高，0.2 mg/mL和0.4 mg/mL组细胞存活率显著性增高(P<0.001)。

图1 人参皂苷Rb1对PC12细胞增殖的影响

图2 人参皂苷Rb1对PC12细胞存活率的影响

2.3人参皂苷Rb1对PC12细胞的HO-1基因转录水平的影响 利用qRT-PCR方法，检测人参皂苷Rb1对PC12细胞HO-1基因的转录水平的影响。研究结果显示，与模型组比较，人参皂苷Rb1(0.4 mg/mL)组的HO-1基因转录水平显著升高(P<0.001，图3A)，而对照组的HO-1基因转录水平无显著性差异(P>0.05，图3A)；人参皂苷Rb1(0.4 mg/mL)组的GCLC基因转录水平与模型组、对照组均无显著性差异(P>0.05，图3B)。

图3 人参皂苷Rb1对PC12细胞的HO-1

3 讨论

目前，针对PD不同病因已在体外建立了多种细胞模型，例如氧化应激损伤模型、缺糖缺氧模型等，它们具有周期短、条件易控、便于重复等优点。PC12细胞有神经内分泌细胞特征，且易存活、可传代、增殖快，被广泛应用于神经系统疾病药物筛选及机制研究中[5]。大量研究表明，自由基损伤是造成PD的重要原因之一，其中ROS与PD发病有着密切的关系。ROS生成过多而体内活性酶的清除能力下降，使得机体处于氧化应激环境之中[6,7]。H2O2作为氧化损伤的诱导剂，化学性质活跃，易于出入细胞，引起细胞毒性而导致细胞死亡。细胞毒性检测主要根据细胞膜通透性的变化。常用的检测方法有MTT、CCK8和LDH等，用于检测细胞存活率。实时无标记细胞分析技术(RealTime Cellular Analysis，RTCA)是近几年出现的新技术手段，可以实时、动态、定量跟踪细胞形态和增殖分化。本研究结果发现，模型组的细胞存活率显著低于正常对照组，提示H2O2诱导细胞损伤模型成功建立。实验组细胞存活率高于模型组，呈剂量依赖性增高，剂量达到0.2 mg/mL出现统计学差异，表明人参皂苷Rb1能够降低PC12细胞中H2O2诱导的细胞损伤。目前大量的研究证据表明，ROS不但有信号转导和调控细胞活性生理功能，还可参与介导多种炎症介质的生物学活性作用及直接或间接损伤细胞的结构[8]。H2O2暴露可增加细胞内ROS或直接参与氧化应激，诱导自由基产生，导致细胞损伤。人参皂苷Rb1可能是通过其抗氧化活性减少自由基产生，降低氧化应激，从而对细胞起到保护作用。

血红素加氧酶(heme oxygenase, HO)是血红素分解代谢过程中的限速酶。HO有三种类型：氧应激诱导型HO-1、组成型HO-2及尚未明确的HO-3。HO -1本身及其代谢产物均有抗氧化损伤的功能，临床上以HO-1的表达量作为组织氧化应激水平的重要参考。研究证实，HO-1基因的上调对细胞氧化损伤具有保护作用[9]。本研究结果显示人参皂苷Rb1能够上调细胞内HO-1基因表达，提示人参皂苷Rb1可能通过上调HO-1基因表达发挥对H2O2诱导细胞损伤的保护作用，其上调机制还需进一步验证。

综上所述，人参皂苷Rb1能够对抗H2O2诱导的细胞损伤，提高细胞存活率，起到保护作用。人参皂苷Rb1可能是通过上调HO-1基因表达，增加抗氧化能力，降低氧化应激损伤而完成，具体机制还需进一步设计实验验证。