七叶皂苷钠通过p38MAPK 通路减少大鼠心肌梗死面积和无复流面积的研究

文俊杰苏 展∗罗素新

(1.广安市人民医院心血管内科,四川广安 638000; 2.重庆医科大学附属第一医院心血管内科,重庆 400016)

急性心肌梗死是临床常见的心血管系统疾病,以冠状动脉闭塞引起的心肌组织缺血缺氧损害为基本特征,及时进行经皮冠状动脉介入术以及溶栓治疗能够迅速再通冠脉、使缺血心肌获得血流再灌注,但仍有部分患者在冠脉再通后缺血的心肌组织无法获得有效的血流灌注、甚至无灌注,表现为心肌血循环血流受限,这一现象称为无复流[1-2]。无复流的发生会使心肌梗死面积扩大、加重心肌缺血缺氧损伤,可引起心力衰竭、恶性心律失常等严重并发症的发生,需要进行积极防治。

目前的研究认为,与无复流相关的因素包括缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)损伤、微血管栓塞、细胞凋亡、炎症反应等,针对上述因素进行干预对无复流具有防治作用[3-5]。七叶皂苷钠(sodium aescinate, SA)是提取自七叶树干燥成熟的果实,对肠、视网膜等组织的I/R 损伤具有保护作用[6-7],并且根据王艳蕾等[7]的动物实验研究,抑制p38 丝裂原活化蛋白激酶信号通路(p38 mitogen activated protein kinase pathway, p38MAPK)通路是SA 发挥保护作用的分子机制。p38MAPK 属于MAPK 家族,在心肌 I/R 损伤过程中,p38MAPK 抑制剂SB203580 能够减轻I/R 引起的心肌细胞凋亡及炎症反应激活[8],但能够抑制p38MAPK 激活的SA 是否在心肌I/R 中起到保护作用并改善无复流尚未明确。基于此,本实验将以大鼠心肌I/R 后无复流模型为研究对象,观察SA 通过p38MAPK 通路减小心肌梗死面积及无复流面积的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF 级成年雄性SD 大鼠,共112 只,购自上海杰思捷实验动物有限公司[SCXK(沪)2018-0004],在重庆医科大学实验动物中心饲养[SYXK(渝)2019-0013],8～10 周龄、200～220 g。实验经重庆医科大学生物医学伦理委员会审批(2020XM0016);实验过程遵循3R 原则。

1.2 主要试剂与仪器

SA、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)、硫黄素S购自Sigma 公司;p38MAPK 过表达腺病毒由上海吉凯公司合成;白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒购自上海西唐公司;RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒购自上海碧云天公司;Bcl-2 相关X 蛋白(Bax)、裂解型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved caspase-3)的抗体购自 Abcam 公司;p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK 的抗体购自CST 公司。显微镜为日本Nikon 公司;酶标仪为美国Bio-tek 公司;电泳系统为美国Bio-rad 公司;凝胶成像系统为上海天能公司。

1.3 实验方法

1.3.1 无复流动物模型的制备

大鼠麻醉后,在左侧第4、5 肋间做切口,打开胸腔、暴露心脏,在左心耳下方2 mm 处的冠状动脉左前降支下穿线,在线与血管之间放置长度约0.5 cm的软硅胶管,结扎冠脉后将心脏放回胸腔,用动脉夹暂时夹闭切口,缺血4 h 后打开动脉夹、显露心脏,剪断硅胶管时心肌获得血流再灌注、持续8 h,再灌注结束后经股静脉注射6%硫黄素S 溶液1 mL/kg。假手术操作按照相同的方法做手术切口、显露心脏并在冠状动脉左前降支下穿线,但不结扎,相同时间后经股静脉注射6%硫黄素S 溶液1 mL/kg。

1.3.2 动物分组及干预

SD 大鼠随机分为对照组、I/R 组、I/R+SA 组、空白腺病毒+I/R 组、p38MAPK 腺病毒+I/R 组、空白腺病毒+I/R+SA 组、p38MAPK 腺病毒+I/R+SA组,每组各16 只。对照组进行假手术,I/R 组进行造模,I/R+SA 组进行造模并给予SA 干预,空白腺病毒+I/R 组进行造模并给予空白腺病毒注射,p38MAPK 腺病毒+ I/R 组进行造模并给予p38MAPK 过表达腺病毒注射,空白腺病毒+I/R+SA组进行造模并给予空白腺病毒注射、SA 干预,p38MAPK 腺病毒+I/R+SA 组进行造模并给予p38MAPK 过表达腺病毒注射、SA 干预。SA 干预方法如下:采用注射用水配置浓度为0.18 mg/mL 的SA 注射液,参照王艳蕾等[7]的研究确定SA 的剂量为0.9 mg/kg,在缺血前、再灌注前、再灌注后30 min 时,分别给予5 mL/kg SA 注射液(含有0.9 mg/kg SA)尾静脉注射;

在缺血前、再灌注前、再灌注后30 min,分别给予0.9 mg/kg SA 尾静脉注射;腺病毒干预方法如下:开胸后在缺血前进行腺病毒注射,将病毒滴度为1.2×1010TU/mL 的腺病毒注射在左心室游离壁上、下、左、右 4 个点、每点注射 50 μL。

1.3.3 心肌无复流面积的硫黄素S 染色测定

每组大鼠随机选择8 只,处死后取出心脏,生理盐水冲洗后从左冠状动脉结扎水平往下、将心脏切为厚度相等的5 片,放入薄层色谱仪、在365 nm 波长下观察心脏切片,无复流区域硫黄素S 不染色、呈暗褐色,复流区域硫黄素S 染色、呈蓝绿色,计算无复流区面积占总面积的百分比。

1.3.4 心肌梗死面积的TTC 染色测定

完成硫黄素S 染色测定后,将心脏切片放入TTC 溶液中,室温避光染色3 min,观察心脏切片并拍照记录,梗死区域TTC 不染色、呈灰白色,非梗死区域TTC 染色、呈红色,计算梗死区域面积占总面积的百分比。

1.3.5 心肌中炎症因子含量的ELISA 检测

每组大鼠剩余的8 只处死,取缺血心肌组织适量,加入RIPA 裂解液后匀浆,匀浆液以12000 r/min的速度离心10 min,得到上清后采用BCA 试剂盒检测蛋白含量,采用 ELISA 试剂盒检测 IL-1β、TNF-α、ICAM-1 的含量,计算上清中每毫克蛋白所对应的IL-1β、TNF-α、ICAM-1 的含量。

1.3.6 心肌中基因表达的Western blot 检测

另取缺血心肌组织匀浆后的离心上清,根据蛋白检测结果,取含有30 μg 蛋白的上清,加入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,而后电转移至PVDF 膜,5%脱脂牛奶室温封闭 PVDF 膜 1 h,1 ∶1000 的 bax、cleaved caspase-3、p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK 抗体4℃孵育过夜;次日,洗膜 3 次、每次 5 min,1 ∶2000 的第二抗体室温孵育1 h,再次洗膜3 次、每次10 min,最后在凝胶成像系统中显影得到蛋白条带,根据蛋白条带的灰度值计算蛋白表达量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件录入数据,计量资料经正态性检验、符合正态分布的数据以平均数±标准差(±s)表示,多组间的比较采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SA 对心肌I/R 大鼠心肌无复流面积及梗死面积的影响

与对照组比较,I/R 组大鼠心肌的无复流面积及梗死面积均明显增加(P<0.05);与I/R 组比较,I/R+SA 组大鼠心肌的无复流面积及梗死面积均明显缩小(P<0.05)。见图1、表1。

表1 三组大鼠心肌无复流面积及梗死面积的比较( ±s,n=8)Table 1 Comparison of no reflow area and infarct size of rats among 3 groups

表1 三组大鼠心肌无复流面积及梗死面积的比较( ±s,n=8)Table 1 Comparison of no reflow area and infarct size of rats among 3 groups

注:与对照组比较,∗P<0.05;与I/R 组比较,#P<0.05。Notes.Compared with control group, ∗P<0.05.Compared with I/R group, #P<0.05.

组别Groups无复流面积No reflowarea梗死面积Infarct size对照组Control group / /I/R 组I/R group 20.21±5.41∗ 34.58±8.84∗I/R+SA 组I/R+SA group 7.72±1.96# 13.47±4.57#

2.2 SA 对心肌I/R 大鼠心肌中炎症因子含量的影响

与对照组比较,I/R 组大鼠心肌中IL-1β、TNF-α、ICAM-1 的含量明显增加(P<0.05);与 I/R 组比较,I/R+SA 组大鼠心肌中 IL-1β、TNF-α、ICAM-1 的含量明显降低(P<0.05)。见表2。

2.3 SA 对心肌I/R 大鼠心肌中细胞凋亡率及凋亡基因表达的比较

与对照组比较,I/R 组大鼠心肌中细胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3 的表达量明显增加(P<0.05);与I/R 组比较,I/R+SA 组大鼠心肌中细胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3 的表达量明显降低(P<0.05)。图2、图3、表3。

表2 三组大鼠心肌中 IL-1β、TNF-α、ICAM-1 含量的比较( ±s,n=8, ng/mgPro)Table 2 Comparison of IL-1 β, TNF-α and ICAM-1 contents in myocardium of rats among 3 groups

表2 三组大鼠心肌中 IL-1β、TNF-α、ICAM-1 含量的比较( ±s,n=8, ng/mgPro)Table 2 Comparison of IL-1 β, TNF-α and ICAM-1 contents in myocardium of rats among 3 groups

注:与对照组比较,∗P<0.05;与I/R 组比较,#P<0.05。Notes.Compared with control group, ∗P<0.05.Compared with I/R group, #P<0.05.

组别Groups IL-1β TNF-α ICAM-1对照组Control group 1.31±0.25 0.89±0.18 4.28±0.41 I/R 组I/R group 4.23±0.89∗ 3.02±0.68∗ 8.38±2.35∗I/R+SA 组I/R+SA group 2.44±0.77# 1.55±0.32# 6.01±0.94#

图1 三组大鼠心脏的硫黄素S 染色及N-BT 染色Figure 1 Thioflavin S staining and N-BT staining of rat hearts in 3 groups

2.4 SA 对心肌 I/R 大鼠心肌中 MAPK 通路的影响

与对照组比较, I/R 组大鼠心肌中 pp38MAPK、p-JNK 的表达量明显增加,p-ERK1/2 的表达量明显降低(P<0.05);与I/R 组比较,I/R+SA组大鼠心肌中p-p38MAPK 的表达量明显降低(P<0.05),p-ERK1/2、p-JNK 的表达量无明显变化(P>0.05)。图4、表4。

图2 三组大鼠心肌TUNEL 染色图Figure 2 TUNEL staining of myocardium of rats in 3 groups

图3 三组大鼠心肌中Bax、Cleaved caspase-3 的蛋白条带Figure 3 Protein bands of Bax, Cleaved caspase-3 in myocardium of rats in 3 groups

表3 三组大鼠心肌细胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3 表达量的比较( ±s,n=8)Table 3 Comparison of apoptosis rate and Bax, Cleaved caspase-3 expression in myocardium of rats among 3 groups

表3 三组大鼠心肌细胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3 表达量的比较( ±s,n=8)Table 3 Comparison of apoptosis rate and Bax, Cleaved caspase-3 expression in myocardium of rats among 3 groups

注:与对照组比较,∗P<0.05;与I/R 组比较,#P<0.05。Notes.Compared with control group, ∗P<0.05.Compared with I/R group, #P<0.05.

组别Groups凋亡率Apoptosis rate Bax Cleaved caspase-3对照组Control group 1.27±0.42 0.82±0.23 0.30±0.09 I/R 组I/R group 17.67±3.28∗ 1.55±0.32∗ 0.83±0.24∗I/R+SA 组I/R+SA group 9.29±1.85# 0.70±0.1# 0.41±0.10#

2.5 p38MAPK 腺病毒局部注射过表达p38MAPK 的效果验证

与空白腺病毒+I/R 组比较,p38MAPK 腺病毒+I/R 组大鼠心肌中p38MAPK 的表达量明显增加,空白腺病毒+I/R+SA 组大鼠心肌中p38MAPK 的表达量明显降低(P<0.05);与空白腺病毒+I/R+SA 组比较,p38MAPK 腺病毒+I/R+SA 组大鼠心肌中p38MAPK 的表达量明显增加(P<0.05)。见图5、表5。

图4 三组大鼠心肌中p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK 的蛋白条带Figure 4 Protein bands of p-p38MAPK, p-ERK1/2,p-JNK in myocardium of rats in 3 groups

表4 三组大鼠心肌中p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK 表达量的比较( ±s,n=8)Table 4 Comparison of p-p38MAPK, p-ERK1/2, p-JNK expression in myocardium of rats among 3 groups

表4 三组大鼠心肌中p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK 表达量的比较( ±s,n=8)Table 4 Comparison of p-p38MAPK, p-ERK1/2, p-JNK expression in myocardium of rats among 3 groups

注:与对照组比较,∗P<0.05;与I/R 组比较,#P<0.05。Notes.Compared with control group, ∗P<0.05.Compared with I/R group, #P<0.05.

组别Groups p-p38MAPK p-ERK1/2 p-JNK对照组Control group 0.32±0.08 0.81±0.22 0.25±0.08 I/R 组I/R group 0.74±0.23∗ 0.30±0.09∗ 0.89±0.15∗I/R+SA 组I/R+SA group 0.40±0.09# 0.33±0.08 0.83±0.19

图5 四组大鼠心肌中p-p38MAPK 的蛋白条带Figure 5 Protein bands of p-p38MAPK in myocardium of rats in 4 groups

2.6 p38MAPK 腺病毒局部注射对SA 减小心肌I/R 大鼠无复流面积及梗死面积的影响

与空白腺病毒+I/R 组比较,p38MAPK 腺病毒+I/R 组大鼠心肌的无复流面积及梗死面积均明显增加,空白腺病毒+I/R+SA 组大鼠心肌的无复流面积及梗死面积均明显降低(P<0.05);与空白腺病毒+I/R+SA 组比较,p38MAPK 腺病毒+I/R+SA 组大鼠心肌的无复流面积及梗死面积均明显增加(P<0.05)。见图6、表6。

2.7 p38MAPK 腺病毒局部注射对SA 减少心肌I/R 大鼠心肌中炎症因子含量的影响

与空白腺病毒+I/R 组比较,p38MAPK 腺病毒+I/R 组大鼠心肌中 IL-1β、TNF-α、ICAM-1 的含量均明显增加,空白腺病毒+I/R+SA 组大鼠心肌中IL-1β、TNF-α、ICAM-1 的含量均明显降低(P<0.05);与空白腺病毒+I/R+SA 组比较,p38MAPK 腺病毒+I/R+SA 组大鼠心肌中 IL-1β、TNF-α、ICAM-1 的含量均明显增加(P<0.05)。见表7。

表5 四组大鼠心肌中p-p38MAPK 表达量的比较( ±s,n=8)Table 5 Comparison of p-p38MAPK, expression in myocardium of rats among 4 groups

表5 四组大鼠心肌中p-p38MAPK 表达量的比较( ±s,n=8)Table 5 Comparison of p-p38MAPK, expression in myocardium of rats among 4 groups

注:与空白腺病毒+I/R 组比较,aP<0.05;与空白腺病毒+I/R+SA 组比较,bP<0.05。Note.Compared with blank adenovirus+I/R group, aP<0.05.Compared with blank adenovirus+I/R+SA group, bP<0.05.

组别Groups p-p38MAPK空白腺病毒+I/R 组Blank adenovirus+I/R group 0.70±0.19 p38MAPK 腺病毒+I/R 组p38MAPK adenovirus+I/R group 1.42±0.31a空白腺病毒+I/R+SA 组Blank adenovirus+I/R+SA group 0.49±0.08a p38MAPK 腺病毒+I/R+SA 组p38MAPK adenovirus+I/R+SA group 1.09±0.25b

图6 四组大鼠心脏的硫黄素S 染色及N-BT 染色Figure 6 Thioflavin S staining and N-BT staining of rat hearts in 4 groups

表6 四组大鼠心肌无复流面积及梗死面积的比较( ±s,n=8)Table 6 Comparison of no reflow area and infarct size of rats among 4 groups

表6 四组大鼠心肌无复流面积及梗死面积的比较( ±s,n=8)Table 6 Comparison of no reflow area and infarct size of rats among 4 groups

注:与空白腺病毒+I/R 组比较,aP<0.05;与空白腺病毒+I/R+SA 组比较,bP<0.05。Note.Compared with blank adenovirus+I/R group, aP<0.05.Compared with blank adenovirus+I/R+SA group, bP<0.05.

组别Groups无复流面积No reflow area梗死面积Infarct size空白腺病毒+I/R 组Blank adenovirus+I/R group 17.41±5.77 30.77±7.97 p38MAPK 腺病毒+I/R 组p38MAPK adenovirus+I/R group 24.29±6.02a 42.83±9.34a空白腺病毒+I/R+SA 组Blank adenovirus+I/R+SA group 9.51±1.77a 14.86±3.61a p38MAPK 腺病毒+I/R+SA 组p38MAPK adenovirus+I/R+SA group 19.38±4.86b 27.14±7.24b

2.8 p38MAPK 腺病毒局部注射对SA 调节心肌I/R 大鼠心肌中细胞凋亡的影响

与空白腺病毒+I/R 组比较,p38MAPK 腺病毒+I/R 组大鼠心肌中细胞凋亡率及 Bax、Cleaved caspase-3 的表达量均明显增加,空白腺病毒+I/R+SA 组大鼠心肌中细胞凋亡率及 Bax、 Cleaved caspase-3 的表达量均明显降低(P<0.05);与空白腺病毒+I/R+SA 组比较,p38MAPK 腺病毒+I/R+SA组大鼠心肌中细胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3的表达量均明显增加(P<0.05)。见图7、图8、表8。

3 讨论

无复流是影响急性心肌梗死再灌注治疗效果的重要因素,如何防治无复流、增加缺血心肌有效的血流灌注是心血管相关研究的热点。在心肌I/R过程中会出现无复流,国内张金艳等[9]的动物实验发现结扎左冠状动脉前降支使心肌经历缺血4 h、再灌注8 h 后心肌发生无复流。本实验采用相同的方法建立了大鼠心肌I/R 后无复流模型,通过硫黄素S 染色及N-BT 染色后观察到I/R 大鼠出现了心肌梗死及无复流,本实验也将在此模型中研究无复流的防治手段。

表7 四组大鼠心肌中IL-1β、TNF-α、ICAM-1 含量的比较( ±s,n=8, ng/mgPro)Table 7 Comparison of IL-1 β, TNF-α and ICAM-1 contents in myocardium of rats among 4 groups

表7 四组大鼠心肌中IL-1β、TNF-α、ICAM-1 含量的比较( ±s,n=8, ng/mgPro)Table 7 Comparison of IL-1 β, TNF-α and ICAM-1 contents in myocardium of rats among 4 groups

注:与空白腺病毒+I/R 组比较,aP<0.05;与空白腺病毒+I/R+SA 组比较,bP<0.05。Note.Compared with blank adenovirus+I/R group, aP<0.05.Compared with blank adenovirus+I/R+SA group, bP<0.05.

组别Groups IL-1β TNF-α ICAM-1空白腺病毒+I/R 组Blank adenovirus+I/R group 4.50±0.92 3.22±0.73 8.56±2.51 p38MAPK 腺病毒+I/R 组p38MAPK adenovirus+I/R group 6.09±0.94a 4.41±0.88a 9.93±2.77a空白腺病毒+I/R+SA 组Blank adenovirus+I/R+SA group 2.65±0.88a 1.45±0.35a 6.44±1.03a p38MAPK 腺病毒+I/R+SA 组p38MAPK adenovirus+I/R+SA group 4.61±0.83b 3.41±0.77b 8.24±2.25b

图7 四组大鼠心肌TUNEL 染色图Figure 7 TUNEL staining of myocardium of rats in 4 groups

表8 四组大鼠心肌细胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3 表达量的比较( ±s,n=8)Table 8 Comparison of apoptosis rate and Bax, Cleaved caspase-3 expression in myocardium of rats among 4 groups

表8 四组大鼠心肌细胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3 表达量的比较( ±s,n=8)Table 8 Comparison of apoptosis rate and Bax, Cleaved caspase-3 expression in myocardium of rats among 4 groups

注:与空白腺病毒+I/R 组比较,aP<0.05;与空白腺病毒+I/R+SA 组比较,bP<0.05。Note.Compared with blank adenovirus+I/R group, aP<0.05.Compared with blank adenovirus+I/R+SA group, bP<0.05.

组别Groups 凋亡率Apoptosis rate Bax Cleaved caspase-3空白腺病毒+I/R 组 Blank adenovirus+I/R group 19.11±4.09 1.45±0.35 0.69±0.12 p38MAPK 腺病毒+I/R 组 p38MAPK adenovirus+I/R group 29.67±5.52a 2.14±0.71a 1.09±0.32a空白腺病毒+I/R+SA 组 Blank adenovirus+I/R+SA group 9.29±1.85a 0.83±0.14a 0.37±0.09a p38MAPK 腺病毒+I/R+SA 组 p38MAPK adenovirus+I/R+SA group 16.67±4.23b 1.78±0.51b 1.10±0.36b

图8 四组大鼠心肌中Bax、Cleaved caspase-3 的蛋白条带Figure 8 Protein bands of Bax, Cleaved caspase-3 in myocardium of rats in 4 groups

I/R 损伤、炎症反应、细胞凋亡是与无复流发生相关的机制,而七叶树干燥成熟果实提取物SA 能够减轻视网膜I/R 损伤、肠I/R 损伤。本实验将SA用于心肌I/R 后无复流的防治,在缺血区、再灌注前、再灌注后30 min 分别进行SA 腹腔注射,经SA干预后,大鼠的心肌梗死面积及无复流面积均明显缩小。SA 缩小心肌梗死面积、减轻I/R 损伤的作用与其在视网膜I/R 损伤、肠I/R 损伤中的保护作用吻合;而SA 缩小无复流面积的作用表明SA 对心肌I/R 后无复流具有改善作用。

多项临床研究表明,bax 等凋亡分子及TNF-α等炎症因子与无复流发生有关且相应的干预手段能够抑制凋亡、炎症并改善无复流[10-11];另有冠脉微栓塞的动物实验表明,Bax 的高表达以及TLR4 炎症通路的激活与冠脉微栓塞的发生有关,进而可能引起无复流[12-13]。本实验对心肌I/R 后无复流大鼠细胞凋亡及炎症因子的检测证实,心肌中细胞凋亡率、Bax、Cleaved caspase-3 的表达量及 IL-1β、TNF-α、ICAM-1 的含量均明显增加,与既往其他学者关于细胞凋亡、炎症反应与无复流关系的研究结果吻合。在给予 SA 干预后,心肌中细胞凋亡率、Bax、Cleaved caspase-3 的表达量及 IL-1β、TNF-α、ICAM-1的含量均明显减少,表明SA 能够在心肌I/R无复流的过程中起到抗炎及抗凋亡作用,与已知的SA 生物学活性吻合,也提示抗炎和抗凋亡是SA 改善心肌I/R 后无复流的可能机制。

MAPK 信号通路是细胞内调控炎症反应及细胞凋亡的重要通路,MAPK 家族包括 p38MAPK、ERK1/2、JNK 等多个成员,以磷酸化的形式发生激活。既往研究报道,在心肌I/R 的过程中,具有促凋亡及促炎作用的 p-p38MAPK、p-JNK 表达增多,具有抗凋亡及抗炎作用的p-ERK1/2 表达减少[14-16]。本实验的分析同样证实 I/R 大鼠心肌中 pp38MAPK、p-JNK 的表达增加,p-ERK1/2 的表达减少。在 SA 减轻肠 I/R 损伤的过程中,p38MAPK 的磷酸化受到抑制,提示SA 可能通过p38MAPK 通路发挥保护作用;本实验在使用SA 干预后观察到:pp38MAPK 的表达减少,而 p-JNK、p-ERK1/2 的表达无明显变化,说明SA 能够在心肌I/R 过程中抑制p38MAPK 的磷酸化,但不影响MAPK 家族中另两个成员 ERK1/2 及 JNK 的磷酸化,进而提示抑制p38MAPK 通路及其介导的炎症反应、细胞凋亡可能是SA 在心肌I/R 后无复流中发挥改善作用的分子机制。

为了验证p38MAPK 通路在SA 改善心肌 I/R后无复流中的确切作用,本实验构建了p38MAPK过表达腺病毒,通过腺病毒注射的方式来增加心肌中p38MAPK 的表达。在心肌 I/R 后无复流造模前,注射 p38MAPK 过表达腺病毒能够增加 pp38MAPK 的表达并增加无复流面积、加重细胞凋亡及炎症反应,表明p38MAPK 直接参与了心肌组织中炎症反应及细胞凋亡的调控,同时过度激活的p38MAPK 能够加重无复流。在造模并给予 SA 干预的过程中,注射p38MAPK 过表达腺病毒能够削弱SA 缩小无复流面积、抑制细胞凋亡及炎症反应的作用,这直接表明p38MAPK 通路在SA 改善心肌I/R 后无复流中起重要作用, SA 通过抑制p38MAPK 在心肌I/R 后无复流中起改善作用。

综上所述,SA 能够改善大鼠心肌I/R 后无复流并抑制细胞凋亡、炎症反应,抑制p38MAPK 通路是SA 发挥上述作用相关的分子机制,未来SA 有望成为急性心肌梗死再灌注治疗过程中减小梗死面积及无复流面积的备选药物,使用SA 治疗可能对急性心肌梗死的治疗结局具有改善作用。