中医药干预细胞外基质沉积抗肺纤维化研究进展*

张冬冬，刘晓明，李芮

1.山东中医药大学，山东 济南 250014； 2.山东省中医院，山东 济南 250014

细胞外基质(extracellular matrixc，ECM)是一种非细胞的大分子三维网状结构，主要由多种纤维蛋白和多糖等组成，在机体生理、病理状态下，经历不断地降解重构过程，保证自身生成降解协调，维持内环境的稳态平衡[1]。ECM在肺间质的大量沉积是肺纤维化病理特点之一。起始阶段肺泡上皮细胞损伤，刺激生成多种促纤维化细胞因子诱导成纤维细胞增生、聚集、转分化，生成分泌ECM更强的肌成纤维细胞[2]，高水平释放ECM，促进肺纤维化发生。病理状态下，肺间质中ECM的过量沉积可促使ECM合成增加，并使降解酶系基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)/组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)调控功能降低。因此，抑制转化生长因子的表达激活，维持降解酶系的比例平衡，可延缓肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)的病情进展。

1 TGF-β1、MMPs/TIMPs与肺纤维化

大量研究表明，TGF-β1与基质金属蛋白酶及其抑制因子之间存在多向调节机制，三者之间相互作用，互相关联，均在细胞外基质的生成与降解中发挥重要作用。

1.1 MMPs/TIMPs与肺纤维化正常肺组织中MMPs/TIMPs处于动态平衡，两者的比例失衡是导致ECM降解减少的重要原因[3]。MMPs是降解细胞外基质的主要酶群，ECM的所有成分几乎都能被其降解。正常肺组织中MMPs表达水平较低，由多种细胞以pro-MMPs的形式释放到细胞间隙，在受到刺激时活化，旨在降解因炎症等病理因素被破坏的ECM，保持ECM的结构及功能协调有序[4]。先前有研究认为，MMPs可降解ECM，对肺纤维化有延缓作用。近年来有研究发现，MMPs还可以调控多种生物活性因子(如TGF-β1)的释放、激活，部分MMPs在肺纤维化过程中起到了促进作用[5]。MMPs能合成并发挥其正常生理功能，主要靠转录激活、转录后的酶原活化和内源性抑制因子来调控[6]。

TIMPs是MMPs的特异性内源抑制因子，它与MMPs的活性位点以11的比例相结合。TIMPs除了可以抑制MMPs活性外，还可以因纤维细胞增生、胶原合成增加ECM的沉积，加快肺纤维化进程。

研究发现，博莱霉素造模小鼠中MMPs、TIMPs表达水平均始终高于正常组[7-8]。谭善忠等[9]观察利用博莱霉素诱导大鼠肺纤维化改变过程中ECM降解酶系的蛋白表达情况发现，在肺组织纤维化病变早期，MMPs蛋白表达明显增加，TIMPs蛋白增加不明显；至中后期，MMPs蛋白表达活跃度逐渐下降，但始终高于正常水平，TIMPs蛋白表达开始呈显著上升趋势。由此可推断，在肺纤维化形成早期，MMPs/TIMPs比值升高，中后期逐渐下降，始终处于比例失衡状态。赵承杰等[10]通过临床观察发现，服用吡非尼酮治疗特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)的患者，MMPs水平较治疗前降低，肺功能得到了明显改善。因此，恢复MMPs/TIMPs的正常稳态平衡是PF的重要治疗靶点之一。

1.2 TGF-β1信号通路与肺纤维化TGF-β1由肺上皮细胞、巨噬细胞等产生，是促纤维化能力最强的纤维化因子[11]，研究表明，特发性肺纤维化患者外周血中TGF-β1含量明显高于正常人[12]，因其可通过多途径诱导肺纤维化的形成，被认为是促进IPF形成的核心介导因子[13]。TGF-β1可诱导肺组织中的成纤维细胞增生，转化为有更高分泌胶原蛋白的ECM成分，被视为肺纤维化形成的终端效应细胞的肌成纤维细胞[2，14-16]，能增加ECM的合成。有研究证实，TGF-β1、MMP-9、TIMP-1蛋白及基因表达在博来霉素诱导大鼠形成肺纤维化过程中呈动态变化，但始终高于正常表达水平[17]，且在正常小鼠TGF-β1转基因后，MMP-2蛋白表达降低，TIMP-1，2，3蛋白表达增强[18]。TGF-β1还可调控MMPs/TIMPs比例，使ECM降解减少，沉积增加。大量实验表明，肺纤维化模型中TGF-β1信号通路下游信号Smad3蛋白升高，在使用Smad3蛋白特异性抑制剂对博来霉素诱导的大鼠施行干预后发现，Smad3蛋白信号通路是促进肺纤维化的重要途径[19]。有研究发现，在肺纤维化大鼠模型中，TGF-β1、Smad3、TIMP及胶原蛋白增多，在给予抗纤维化治疗后，TGF-β1、Smad3、TIMP及胶原蛋白表达降低，Smad7、MMP表达升高，纤维化程度减轻[15]。由此可知，Smad7可妨碍TGF-β1介导的信号通路，干扰TGF-β1对MMPs/TIMPs的调控作用。

2 中医药在PF过程中对TGF-β、MMPs/TIMPs干预作用的研究

古代文献中并没有与肺纤维化相对应的中医病名和明确记载，现代医家根据其临床表现，常将其归属于“肺痿”“肺痹”等范畴。西医多应用激素、免疫抑制剂来控制病情进展，但并不能逆转病理改变，且疗效不佳，不良反应大，价格较高，加重了患者的经济负担。我国拥有丰富的中草药资源，经过数千年的传承，中医辨病辨证理论已趋于成熟，且中医药在此次治疗新型冠状病毒性肺炎肺纤维化过程中发挥了不可估量的作用，许多中药制剂被广泛应用于临床，收效显著。

2.1 单药及衍生物有学者对数据库中近20年来中药治疗肺纤维化的文献进行筛选归纳排序分析，发现活血、补虚、滋阴、清热四类中药占比较大，黄芪、甘草、丹参在组方中出现频率最高[20]。

2.1.1 补气益肺类 栾智华等[21]观察黄芪糖蛋白对肺纤维化模型小鼠的干预作用，发现黄芪糖蛋白可明显减轻小鼠肺纤维化程度，降低肺组织中 TGF-β1 含量。另外，郭启芬等[22]运用复方赤芍黄芪提取物 (compound of Radix Paeoniae Rubra and Astragalus extract，CRAE)治疗肺纤维化大鼠，4周后进行相关指标检测，中高剂量治疗组血清中的ECM成分、TGF-β1、Smad2蛋白、Smad3蛋白、TIMP-1含量均降低，同时上调了 Smad7蛋白、MMP-9的表达，CRAE通过干预TGF-β1/Smads信号通路，调控ECM的生成与降解，抑制肺纤维化的进展。

甘草酸二铵可减少肺纤维化大鼠肺组织中转化生长因子的产生及其转录基因的表达[23]。付钰等[24]利用甘草查尔酮A治疗肺纤维化小鼠，与模型组对比，结果显示，治疗组α-平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白、Ⅰ型胶原蛋白表达及Smad2/3蛋白磷酸化水平均降低，Smad信号通路被阻断，成纤维细胞转化受到抑制，肺纤维化进展延缓。

陈盼盼等[25]观察人参总皂苷(total ginsenoside，TG)对实验性肺纤维化小鼠肺组织中基质金属蛋白酶表达情况的影响，测定结果显示，实验组MMP-2、MMP-9蛋白水平下降，且肺纤维化程度得到一定程度改善。本次实验只测定了MMPs，未测定与之密切相关的TGF-β1/Smads信号通路中的相关指标和TIMPs的变化情况。杨露[26]研究发现，人参总皂苷还可以下调TGF-β1、Smad2、Smad3、TIMP-1，上调Smad7水平，提示人参总皂苷的抗纤维化作用是通过调控TGF-β1/Smads信号通路和ECM降解酶系统实现的。

2.1.2 活血通络类 秦静等[27]发现，丹参素早期应用可抑制TGF-β1、Smad3 mRNA，促进Smad7 mRNA的表达，减轻肺泡炎症和纤维化程度。邵笑等[28]研究认为，丹参酮ⅡA可上调抑制性信号蛋白Smad7，抑制TGF-β1、Smad2受体表达，阻碍肺成纤维细胞的增殖，达到控制肺纤维化的目的。于珊玲发现，丹参单体IH764-3可降低肺纤维化大鼠肺组织中MMP-2、TIMP-1表达，调整两者的比例，减少细胞外基质的沉积[29]。

柯春锦等[30]利用黄芪联合姜黄提取物对PF大鼠进行干预，运用免疫组织化学分析法检测不同时间段大鼠肺组织中MMP-9和TIMP-1的含量，结果显示，1周后MMP-9下降明显，4周后TIMP-1减少较显著，且两者比值呈持续下降趋势。薛爱芹等[31]实验发现，姜黄素干预组肺纤维化大鼠 TGF-β1 表达显著降低。张少波等[32]在姜黄素对肺纤维化小鼠的保护作用及机制研究中发现，中高剂量姜黄素可有效降低MMP-9水平。推测姜黄有效成分可以调控TGF-β1信号通路，影响MMP-9/TIMP-1比值，干预ECM的生成与降解，阻碍肺纤维化。

2.1.3 养阴生津类 张喆[33]以阿胶、黄明胶对成功建立肺纤维化小鼠进行干预，16周后取小鼠肺做病理切片观察发现，阿胶组、黄明胶组小鼠肺间质胶原含量、胶原纤维面积均较对照组减少，测定肺泡灌洗液中MMP-2、MMP-9基因及蛋白表达下降，肺组织中TGF-β1、Smad3蛋白表达下调，实验结果表明，黄明胶组疗效更为显著。

张心月等[34]观察麦冬对肺纤维化小鼠肺组织中的MMP-9及TIMP-1表达的影响，结果显示，麦冬可降低MMP-9、TIMP-1蛋白的表达。

2.1.4 清热解毒类 金晓滢等[35]采用气管内注射博来霉素的方法模拟具有肺纤维化病理特点的大鼠模型，分别在造模前2天(预防组)和造模后第3天、第7天、第14天(治疗组)用虎杖进行干预，发现与模型组相比，预防组和各治疗组纤维化程度及胶原沉积均较轻，通过RT-PCR法检测大鼠肺成纤维细胞中MMP-2及TIMP-1转录基因的表达，提示虎杖可以在肺纤维化的不同发展阶段抑制成纤维细胞中此两种mRNA的过度表达，减少ECM沉积，阻止肺纤维化进展。赵光辉[36]以相同的方式制造肺纤维化大鼠模型，用不同剂量的两种虎杖有效成分(虎杖苷、白藜芦醇)进行治疗，结果显示，虎杖苷治疗组及白藜芦醇治疗组大鼠肺纤维化程度均有不同程度减轻，胶原蛋白沉积减少。虎杖苷治疗组TGF-β1、Samd3表达降低，成纤维细胞/肌成纤维细胞合成减少，且具有高剂量依赖性。两个实验组的研究结果显示，虎杖有效成分可通过抑制TGF-β1/Samd3信号通路，减少成纤维细胞合成转化，进而阻碍 MMP-2 及TIMP-1的表达，减少ECM沉积，对肺纤维化起到治疗作用，此设想有待更为深入的实验研究验证。

实验发现，连翘可降低肺纤维化小鼠肺组织中MMP-9、TIMP-1的含量，调节两者之间的比值，发挥抑制纤维化的作用[34]。

2.2 复方药物

2.2.1 降低TGF-β1表达，减少ECM合成 何钦等[37]研究表明，复方肺形草颗粒(肺形草、山药、党参、麦冬等)可改善患者临床证候、肺功能、血气分析指标，降低TGF-β1水平。贾丹等[38]研究发现，补肺化纤饮加减(三七、水蛭、瓜蒌皮、仙鹤草等)部分作用机制在于降低患者血清中TGF-β1及纤维化指标，减少肺组织中ECM的沉积。付玲等[39]研究结果显示，蒌贝棱术汤(瓜蒌、浙贝、三棱、莪术等)可大幅度降低特发性肺纤维化患者血清 TGF-β1 水平，改善患者肺功能，提高其生活质量。彭艳芳等[40-41]用芪归方(黄芪30 g，当归6 g)治疗特发性肺纤维化，同时做了临床及动物实验，将50名特发性肺纤维化患者随机分为观察组及对照组，观察组在对照组基础上加用芪归方，疗程结束后与对照组比较，观察组患者症状明显改善，活动耐力得到提高，血清TGF-β1明显降低。造模肺纤维化大鼠实验针对TGF-β1信号通路做了更为深入的研究，低、中、高不同剂量芪归方干预组肺纤维化大鼠在用药后的第7天、第28天，微小RNA-21表达均降低，TGF-β1、P-Smad2/3蛋白含量减少，疗效以中剂量最为理想，且具有时间依赖性，治疗时间延长，有助于推进疗效。

2.2.2 调整MMPs和TIMPs失衡发挥作用 任培中等[42]发现，通肺络补宗气方(生黄芪、升麻、旋覆花、威灵仙、海浮石、三棱、莪术、甘草)可降低博来霉素诱导的肺纤维化大鼠肺组织中纤维连接蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、MMP-9、TIMP-1表达含量，减轻肺纤维性增生，推测通肺络补宗气方或许是通过调节MMP-9/TIMP-1比例，减少细胞外基质沉积，提高肺功能，抑制大鼠肺纤维化进程。晏军等[43]研究认为，补肾益肺消癥方可调控MMP-2、MMP-9基因的表达，缓解细胞外基质蛋白及胶原蛋白的沉积，缩减肺纤维化病变范围。乔世举等[44]研究表明，肺痿膏(地龙、麦冬、黄芪、双花等)通过降低肺纤维化大鼠MMP-2和TIMP-1蛋白的过度表达，调节基质金属蛋白酶及其抑制因子之间失衡的比例，降低肺系数及纤维化程度。王祺等[45]经免疫组化染色法测定发现，血府逐瘀汤可抑制MMP-7在纤维化肺组织中的异常表达，减轻肺纤维化程度。

2.2.3 调控TGF-β1信号通路及基质金属蛋白酶系 窦晓燕[46]运用旋覆花汤合参苓白术散化裁治疗IPF患者，观察组有效率达89.47%，血清中TGF-β1 减少，MMP-9/TIMP-1比值降低，透明质酸及胶原含量下降，认为旋覆花汤合参苓白术散加减可减少TGF-β1合成，阻断其信号通路，调整MMPs/TIMPs比例，降低ECM沉积，延缓肺纤维化进展。刘锐等[47]研究麦门冬汤抗纤维化的机制发现，麦门冬汤治疗组肺纤维化大鼠肺组织中TGF-β1、MMP-9和TIMP-1表达水平明显降低。此外，在临床疗效观察中，麦门冬汤治疗组患者透明质酸、层粘蛋白与Ⅲ型前胶原含量较治疗前明显降低，肺功能相关指标明显改善[48]。两组实验结合表明，麦门冬汤拮抗TGF-β1，维持MMPs/TIMPs比例平衡，降低ECM沉积率。张千一等[49]设立动物实验观察遹肺饮(人参、黄芪、白术、沙参等)对肺纤维化大鼠的影响并探讨其作用机制，最终根据实验检测指标得出结论，遹肺饮可以降低肺组织中TGF-β1、MMP-9和TIMP-1蛋白及基因表达水平，调整MMP-9/TIMP-1比例平衡，增加细胞外基质降解量，减少其在肺间质的累积。樊茂蓉等[50]探讨肺痹通方抗肺纤维化机制，结果显示，高剂量肺痹通方治疗组的肺纤维化大鼠血清TGF-β1、层粘连蛋白及肺组织MMP-1、TIMP-1、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白水平均较模型组显著降低，其作用机制在于干预TGF-β1信号分子，调整MMPs/TIMPs之间的比例，降低层黏连蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白的堆积，减轻肺纤维化。

2.3 中成药大量研究表明[51]，丹红注射液临床用于治疗特发性肺纤维化，可降低患者血清中 TGF-β1 及多种ECM成分水平，大幅度改善或消除临床症状，增强肺功能，具有较高的安全性。栾智华等[52]对红花注射液治疗肺纤维化机制进行研究，红花注射液可拮抗肺纤维化小鼠TGF-β1蛋白的表达，改善肺功能。王鑫[53]研究发现，血必净注射液可降低因百草枯所致的纤维化肺损伤大鼠体内MMP-2、MMP-9和TIMP-1的高表达。徐秋颖[54]针对康复新液对PF模型TGF-β1/Smads信号通路的MMPs/TIMPs调节机制进行研究，结果表明，康复新液可降低TGF-β1诱导人胚肺成纤维细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、层粘连蛋白、纤维联结蛋白等mRNA及蛋白的过度表达，可提高TGF-β1诱导肺纤维化细胞模型中MMP-1、MMP-9、Smad2的表达，下调Smad7，明确其作用机制尚待进一步的研究探索。

3 结语

肺纤维化疾病临床致死率高，且其发病率也逐年增高，去年新爆发的新型冠状病毒性肺炎转归期亦呈现纤维化病理表现。目前，PF临床实践用药指南中推荐使用的两种特效药物吡非尼酮、尼达尼布仅可减缓病情进展，且具有不良反应，故大量学者将视线投向了中药。本文从调控ECM生成与降解的TGF-β1-MMPs/TIMPs信号通路着手，总结了近年来治疗肺纤维化疗效显著的单味中药、提取物及中药复方，以期为临床遣方用药治疗肺纤维化拓宽诊疗思路。总结发现，针对此通路的临床研究较少，且样本量小、观察期短，可观察的相关指标存在局限性；动物实验研究大多集中在对TGF-β1、Smads、MMPs/TIMPs三类指标的单独检测，具体作用机制尚不明确，且Smads、MMPs、TIMPs均包括多种家族成员，众成员的功能及它们之间相互产生的作用尚待深入研究。今后，需进一步明确中药发挥抗纤维化的作用机制，为中药临床治疗肺纤维化提供新治疗靶点。