代谢组学在慢性肾脏病中的研究进展*

杨雪，王媛，朱羿霖，史俊，俞曼殊，盛梅笑

南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029

慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)患病率在全球范围内逐年上升，预计占世界人口的9.1%，与终末期肾病及心血管事件发生率、死亡率相关，已成为全球性公共卫生问题[1-3]。目前诊断及分期根据血清肌酐、胱抑素C、肾小球滤过率以及蛋白尿水平等进行评估[4-6]，这些指标往往出现在肾脏损害发生之后，检测结果易受多种因素影响。因此，明确CKD发病机制，筛选敏感且特异的生物标志物在临床的诊断和治疗中具有重要意义。组学是对生物系统在生理、病理状态下的相关信息进行系统全面收集、解析的方法，包括基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等。其中，代谢组学主要研究生物整体、器官或组织的内源性代谢物质的代谢途径及其所受内在或者外在因素的影响，并随时间变化的规律，将代谢物与生物过程关联起来，最终揭示机体内相关因素的变化[7]。基于代谢组学方法对肾脏疾病的研究日益增多，肠道菌群、氨基酸、脂肪酸、嘌呤等代谢通路逐渐受到关注，由此发现的代谢物(组)，如中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)[8]、肾损伤分子-1(kidneyinjury molecule-1，KIM-1)[9]等已逐渐应用于临床，可作为肾脏疾病诊断及预后的生物标志物。本文对代谢组学在CKD发病机制、诊断、预后、中医证型及治疗方面的研究进行综述，旨在为CKD诊断及治疗提供新的研究方向及依据。

1 代谢组学的概念及意义

代谢组学，由英国Nicholson教授等在1999年首次提出，是研究生物体在基因修饰下或受病理生理刺激后所有动态代谢产物的一门学科[10]，研究对象是相对分子质量为1 000 Da以下的内源性小分子代谢物。运用现代分析方法对特定时间内血液、尿液、唾液等体内代谢物的定性、定量进行多参数检测分析[11]，目前已运用于临床诊断、新药研发、 药物有效性、安全性评价、器官移植排斥反应以及植物和微生物等领域[12-13]。但代谢组学在临床上应用较少且受到一定限制，尚处于病因学探索阶段，但其特异性、敏感性的优势，为各种疾病的诊断和机制的研究提供新视角，具有巨大的潜力。

代谢组学方法包括核磁共振谱(nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)、色谱-质谱联用技术两种。后者包括气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)、液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)、超高效液相色谱-质谱(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)等[14]。这些检测方法各有针对性及优缺点，可用于多种化学类别的综合代谢组学分析，应根据研究目的、样本类型以及实验室条件等因素进行选择[15]。NMR具有重复性高、代谢物易于识别和无损伤性等优点，但其监测的分辨率和灵敏度较低，体液标本中可检测出的代谢物一般小于100 个[16]。MS 技术灵敏度、选择性较高，结构识别性更佳，但分析之前需要经GC-MS或LC-MS 分离以降低复杂性，此过程导致稳定性降低，可能改变代谢物的结构，造成结果偏差[17]。通过代谢组学技术分析得到的原始数据，经过主成分分析法、偏最小二乘判别分析法等预处理后，获取所需的生物学信息，包括生物表型及标志物等，检索相关数据库、分析原始数据、获取差异代谢物和分析代谢通路等[18]。

2 代谢组学分析技术在慢性肾脏病研究中的应用

2.1 阐释发病机制研究发现，CKD的发生与内皮功能障碍、氧化应激、肾素-血管紧张素系统的激活以及炎性趋化因子的表达，从而导致进行性肾间质纤维化、肾小管周围毛细血管丢失以及肾小管萎缩导致的功能性肾单位破坏等有关[19-20]，同时伴随着机体脂类代谢、氨基酸代谢、能量代谢以及肠道微生物代谢等代谢功能异常。脂质是生物膜的基本成分，对细胞膜的稳定性和完整性至关重要，CKD的发生也与脂肪酸、甘油磷脂、花生四烯酸代谢通路等有关[21-22]。肾脏纤维化模型大鼠的血清代谢产物中鉴定出 15 种潜在的生物标志物(主要为磷脂和脂肪酸[23])，提示肾脏纤维化可能与脂质代谢紊乱造成的氧化应激反应有关。以Thy1-1诱导系膜增生性肾炎伴或不伴半肾切除模型大鼠与空白组大鼠比较发现，模型大鼠尿液中多不饱和脂肪酸或其氧化代谢物如环氧十八烯酸、环氧二十碳四烯酸以及α-亚麻酸等升高[24]，可参与炎症反应、氧化应激等，导致CKD发生发展。腺嘌呤诱导的慢性肾病模型大鼠血清中二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)、二十二碳五烯酸(docosapentaenoicacid，DPA)、马尿酸、亚油酸等脂肪酸氧化中间产物的上调或下调，可能引起α-平滑肌肌动蛋白、纤溶酶原激活物抑制物-1、转化生长因子-β1等肾纤维化蛋白高表达，导致肾间质纤维化[25]。研究发现，血清中DPA、DHA等多不饱和脂肪酸水平的降低与早期肾损伤有关，而甘油磷脂代谢物如溶血磷脂酰胆碱水平的升高与进展期肾损伤有关[26]，以上两种脂代谢紊乱都是通过导致抗炎系统失衡，从而引起CKD发生发展。

氨基酸是指含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物，是合成蛋白质的基本原料，其分解代谢异常可导致机体氨基酸缺乏，影响蛋白质合成，造成以白蛋白水平下降的营养不良状态以及氨基酸等代谢物升高，引发蛋白尿，导致肾脏损伤[27]。肾硬化患者体内氨基酸分解代谢和合成均减少，其中苯丙氨酸-酪氨酸-多巴胺轴明显下调，推测该代谢途径紊乱与尿液排泄率下降和血压升高有关[28]。切除5/6肾致小鼠CKD模型发现，其血液不对称二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)和对称性二甲基精氨酸等精氨酸代谢物水平升高，产生胶原蛋白和转化生长因子，促进肾脏纤维化，且高水平的ADMA与动脉粥样硬化程度相关[29]。阿霉素诱导早期和晚期肾损伤模型大鼠肾脏，脯氨酸代谢基因表达显著增加，脯氨酸含量升高，晚期肾损伤组上述基因表达上调更明显[26]，提示脯氨酸是检测慢性肾脏病进展的生物标志物。检测200名CKD3～5期患者体内极性血浆代谢物发现，CKD患者血浆中苏氨酸、蛋氨酸、精氨酸和苯丙氨酸水平低于正常组，其中苏氨酸、蛋氨酸、精氨酸与基线eGFR无关[30]，可作为CKD进展的潜在标志物。

CKD的发生发展还与能量代谢通路有关。L运用基质辅助激光解吸/电离质谱成像技术，单侧输尿管梗阻(unilateral uretera obstruction，UUO)大鼠模型发现，CKD的发生与糖酵解、三羧酸循环、ATP代谢等多种能量代谢通路有关，其中肾髓质，受损区域的糖酵解代谢产物葡萄糖水平显著下降，TCA循环中间体柠檬酸以及富马酸的前体物质琥珀酸显著增加，导致肾脏能量代谢中断和线粒体功能障碍，进而活性氧过度产生，通过刺激细胞向成肌纤维细胞的转化，导致肾脏纤维化[31]。

肠道菌群失调及肠道屏障受损可导致细菌移位、内毒素和其他毒素在管腔及循环中沉积，导致CKD和ESRD中促炎细胞因子/趋化因子级联反应的激活[32]。肠道菌群分泌的代谢物还可以导致脂质、胆汁酸、氨基酸、短链脂肪酸等代谢紊乱，从而发挥肾毒性或肾脏保护潜力[33]。研究发现，CKD大鼠肠道菌群结构的组成改变，blautia、escherichia_shigella、bacteroides、allobaculum和clostridium_IV等13种菌种丰度显著变化[34]，这些微生物失调伴随着甘氨酸代谢途径的显著改变。基于毛细管电泳飞行时间质谱代谢组学对腺嘌呤诱导的CKD模型大鼠血浆、粪便和尿液的代谢物谱进行检测发现，肠道菌群可影响短链脂肪酸和氨基酸代谢，导致硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate，IS)和对甲酚硫酸酯等尿毒素溶质累积，加剧CKD肾损伤[35]。研究对一组不同病情的CKD患者粪便样本的肠道菌群相关代谢物分析，发现晚期CKD患者肠道中的IS和对甲酚硫酸盐水平显著升高，蛋类杆菌和普雷沃特氏菌885分别是轻度和重度CKD分类的特异性鉴别菌群，而与疾病进展高度相关的为迷惑魏氏杆菌和粪红粉菌的减少和马西里氏分枝杆菌和甘草酸梭菌的增多[36]。此外，CKD的发生发展还涉及嘌呤、牛磺酸和次牛磺酸等多种代谢途径。

2.2 筛选诊断及预后标志物随着对慢性肾脏病代谢组学的深入研究，一系列能指导CKD诊断及判断预后的代谢物被发现，如色氨酸、氧化三甲胺(trimetlylamine oxide，TMAO)、酰基肉碱等。IS和5-甲氧基色氨酸(5-MTP)是内源性色氨酸代谢物，已被多项研究证明可指导CKD的诊断及预后。IS也是常见的尿毒症毒素，由色氨酸经肠道色氨酸酶转化为吲哚后被宿主吸收并修饰产生，是CKD患者总体死亡率和心血管死亡率的有力预测指标。在5/6肾切除大鼠的血清中发现，IS水平随CKD的进展而升高[37]。研究发现，IS对CKD的影响是通过上调干扰素调节因子-1的表达来抑制肠上皮细胞中的动力相关蛋白-1，从而影响线粒体吞噬功能，导致肠黏膜受损[38]。通过敲除肠道拟杆菌的色氨酸酶基因，可抑制吲哚的产生，降低循环中IS水平，可延缓慢性肾脏病的进展[39]，提示IS与CKD的进展有关，开创了操纵肠道菌群治疗肾脏疾病的新策略。5-MTP是一种色氨酸代谢的5-甲氧基吲哚代谢物，具有抗炎、抗癌、抑制血管重塑的作用。研究发现，5-MTP水平随CKD的进展而降低，提示 5-MTP 是检测早期CKD最具前途的生物标志物。5-MTP在UUO小鼠肾脏中降低，5-MTP及降解酶色氨酸羟化酶-1(tryptophan hydroxylase，TPH-1)可通过激活IκB/NF-κB并抑制Keap1/Nrf2信号传导，进而导致肾间质纤维化[40]，提出TPH-1可作为CKD治疗的潜在靶点。

TMAO是L-肉碱和胆碱经肠道细菌代谢而成的一种代谢物，可导致或加重全身炎症反应。对CKD3～5期患者及健康受试者空腹血浆样品中代谢物水平进行比较发现[41]，CKD透析、非透析患者TMAO水平均高于对照组，且与eGFR呈负相关，肾移植后TMAO水平恢复正常，TMAO水平与白细胞介素(interleukin-6，IL-6)、纤维蛋白原、C反应蛋白等全身性炎症反应标记物呈显著相关性，是CKD3～5患者死亡率的独立预测因子，推测TMAO可能替代eGFR成为CKD的诊断标志物，同样的结论在STUBBS[42]的研究中得到证实。

酰基肉碱经酯化后可经肉碱酰基载体蛋白作用下进入线粒体内完成脂肪酸β-氧化过程，生成ATP细胞正常代谢所需，是细胞内能量代谢所必需的物质，血液或尿液中检测到酰基肉碱即表明存在线粒体损伤及血液中酰基肉碱的浓度增加。酰基肉碱被认为是慢性肾脏病心血管损伤的代谢标志物，WANG等[43]对1 765例50～70岁基线eGFR≥60 mL·(min·1.73m-2)的成人血浆进行代谢组分析，并经过6年的随访观察显示，基线血浆长链酰基肉碱的水平与eGFR下降的发生率呈明显正相关。检测75名未透析的CKD患者的血清和尿液中的肉碱含量发现，血清中酰基肉碱水平随CKD的进展而增加，与eGFR呈负相关[44]，推测CKD患者肉碱缺乏导致肾小管细胞损伤，从而导致肾功能障碍的进展。

2.3 在中医药领域中的应用

2.3.1 阐释中药治疗机制 中药复方基于整体诊断、个体化及非侵袭性用药治疗原则，已被证明具有良好的抗肾纤维化、预防及改善并发症、延缓肾脏病进展等优势[45-46]。中药具有多靶点、多途径、整体调控等的特点。代谢组学整体和动态性研究的特点与中医药的整体观高度吻合，并逐渐应用于中医药相关研究中[47]。肾炎防衰方可以通过对同型半胱氨酸、L-肉碱、肾上腺素等代谢产物及转化生长因子β-1的表达进行综合调节，从而改善肾小球硬化和间质纤维化[48]。黄芪丹参汤对CKD大鼠改善肾小管萎缩和间质纤维化的作用可能是通过调整(E)-油菜素A、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇(130/181)、磷脂酰肌醇(150/203)、磷脂酰丝氨酸和三酰甘油至正常水平而实现的[49]。人参石膏汤可通过调节缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，烟酸和烟酰胺代谢，色氨酸代谢以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等4条主要代谢通路异常，提高胰岛素敏感性、调节肠道菌群、抑制炎症反应等，从而治疗糖尿病肾病[50]。真武汤可调节肠道菌群紊乱，改善肠道菌群造成的营养不良状态，以及调节大鼠体内 HIF-1 信号传导、胆汁分泌、磷酸戊糖和醛固酮合成/分泌等代谢途径，防止肠上皮屏障的破坏，抑制促炎因子释放[51]。经大黄提取物治疗的CKD模型大鼠肠道尿酪胺、苯乙酰甘氨酸、黄嘌呤水平恢复到正常水平，继而改善肾间质纤维化和炎症，这不能阻止 CKD 引起的尿液苯丙氨酸、马尿酸、对甲酚、次黄嘌呤、牛磺酸的变化[52]。黄柏皮对阿霉素肾炎大鼠的治疗作用主要是恢复18种异常的代谢物水平，涉及多种氨基酸代谢、二羧酸代谢、类固醇激素生物合成以及乙醛酸等 9条代谢途径，可降低氧化应激反应、改善肾功能、增强免疫系统功能[53]。

2.3.2 在中医辨证分型中的研究 证是证候的简称，运用四诊合参的方法对疾病某一阶段的病因、病位、病性、病机、病势等病理属性进行总结分析、归纳。采用代谢组学进行临床证候分型的研究日益增多，已经证实中医不同证候存在客观代谢物基础，与机体糖、脂质、氨基酸、能量代谢等方面相关[54]。CKD以脾肾气虚证最多见，其次为脾肾气阴两虚证及阴阳两虚证，随着疾病进展，脾肾气虚、阴阳两虚证有上升趋势[55]。CKD2～3期脾肾气虚证者血清中甘氨酸、甜茶碱升高，半胱氨酸、谷氨酸、醋酸盐含量降低，而气阴两虚组脂质、亮氨酸含量明显升高，半胱氨酸、谷氨酸、醋酸盐水平升高，涉及的代谢途径紊乱为氨基酸、脂质、三羧酸循环等。CKD3～5期脾肾气虚证及脾肾阳虚证患者的代谢差异主要存在于氨基酸、脂肪酸、鞘脂类等化合物，涉及脂肪酸代谢、氨基酸代谢、鞘脂类代谢及亚油酸代谢[56]。脾肾气虚证与气阴两虚证腹膜透析患者血清中存在明显的氨基酸分解代谢紊乱，与气阴两虚组的氨基酸水平比较，脾肾气虚组丙氨酸水平较低，甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸水平较高[57]。而在尿液代谢组学中，慢性肾衰竭早中期脾肾气虚证型患者甘氨酸、牛磺酸、柠檬酸、肌酐、尿素、马尿酸等生物标志物变化显著，主要涉及牛磺酸、亚牛磺酸代谢以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路[58]。这为CKD的微观辨证以及中医用药提供了实验依据，为中医辨证治疗CKD提供新的研究途径。

3 展望

综上所述，慢性肾脏病的发生发展与多个系统、多条代谢通路有关，代谢组学为综合研究肾脏疾病，特别是中医分型和治疗提供了广泛的发展前景和临床应用价值。基于代谢组学的肾脏疾病研究虽然取得了一定进展，但仍存在不足之处：肾脏疾病代谢组学研究多为动物实验研究，且多研究慢性肾脏病、糖尿病肾病等疾病，临床研究特别是中医药临床研究较少；代谢组学数据量庞大，代谢分子性质复杂，缺乏公认的数据平台；多数生物标记物仅处于初步筛查阶段，缺乏系统分析和临床验证；方药加减、剂量改变均可造成代谢物的变化，难以系统统计。今后，应对不同肾脏疾病的不同分型进行深入研究，为疾病的早期诊断、指导治疗提供依据；应科学设计临床研究，扩大样本量，重点开展中药单药、经方、经验方治疗不同分型肾脏疾病的研究。随着代谢组学研究技术的不断进步，其在临床及临床前研究中的应用也将更为广泛和深入，基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等多组学联合应用，为CKD发生发展及诊断提供新的研究思路和方向。