基于中医方剂的活性组分筛选的研究策略与思考*

任周新，李君，刘海军

1.河南中医药大学中医药科学院，河南 郑州 450046；2.呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，河南 郑州 450046；3.河南牧业经济学院，河南 郑州 450044；4.河南省中医药防治呼吸病重点实验室，河南 郑州 450046

组分一词用于中医药研究，较早零星出现于中药化学成分分析和药效学研究文献中［1-3］。张伯礼和王永炎在方剂学研究的总体假说中，首次提出方剂的治疗内核在于方剂中的药物组分，这些组分通过拮抗、补充、整合和调节等作用，对体内的复杂靶点进行干预，产生整体的治疗效应［4］。此后，组分研究得到中医药学界的重视，发展迅猛，成为中医药研究的热点。目前认为：中药组分来源于中药材的有效部位或部位群，是具有一定比例化学成分群构成的组合物［5］。传统方剂配伍的基本单元为中药饮片等天然药材，与之比较，组分具有化学成分可识别，成分比例相对固定，活性一般可表征和重复性好等优点。

方剂组分的研究逐渐集中于两个方向：一是以中医理论为指导，将不同的中药组分配伍，产生相应的药性特征（性、味和归经等），这样的组分方剂，服务于中医临床，针对中医临床症状和证产生防治效应。二是根据临床应用，选择对西医所述某种疾病（如慢性阻塞性肺疾病等）有良好疗效的方剂，应用药物化学、分析化学等方法提取该方剂的有效组分，以临床前的药效学和药代动力学等研究手段评估组分效果，进而筛选出具有潜在疗效的天然药物。本文对后者近些年来的研究成果进行归纳，概括和分析其中的研究策略，期望对未来的研究提供指导和帮助。

1 方剂的确定

方剂有效组分研究的第一步，是收集和完善目的研究疾病相关方剂的信息。之后，应用数据分析技术和信息处理技术分析、处理上述信息，筛选、形成研究用方剂。

1.1 信息的获取根据信息载体的模式，方剂的信息来源主要有印刷形（包括图书、期刊和其他文献）和数字形信息。图书包含工具书，如《中华人民共和国药典》《中医方剂大辞典》［6］《中药大辞典》等，以及专著类，如经典专注《金匮要略》《太平惠民和剂局方》《本草纲目》等以及现代著作如《中医肺病方剂辞典》［7］《名老中医临证经验撷英》［8］等。期刊信息量丰富，高质量的期刊论文引领方剂学科的发展、紧跟学科学术发展的前沿，是方剂药物组分研究领域的重要信息资源。高水平方剂研究的专业期刊有《中国实验方剂学杂志》《中医杂志》《中国中西医结合杂志》《中国中药杂志》以及国外的《Journal of Ethnopharmacology》《American Journal of Chinese Medicine》等。其他方剂研究文献资源包括科技报告、学位论文、产品说明书、专利说明书、标准文献、会议文献等。

数字形信息包括数据库资源和电子期刊，具有信息内容广泛、报道及时、形式多样以及查找、存贮、应用便捷等特点，已经成为科研人员获取、利用信息的主要形式。国内的专业数据库和电子期刊有中国中医药数据库（中国中医科学院中医药信息研究所）、中国知网（CNKI，China National Knowledge Infrastructure）、万方数据资源系统等；国外的有PubMed医学文献检索服务系统（美国国立医学图书馆）以及Web of Science数据库等。

在查阅上述文献信息的基础上，经过用语规范、信息纳入和排除等步骤，设计、构建专用的数据库，以利于后期的数据挖掘和目的方剂组成的确定。

1.2 信息挖掘及目的方剂的组成随着数据分析技术和信息处理技术的快速发展，越来越多先进的数据挖掘工具被应用于方剂配伍规律的研究之中，为探索治疗疾病的特定方剂中核心药物的组成，提供了具有潜在价值的重要信息。如以某些网站上医患互动论坛上的鼻炎相关问答帖为数据来源，采用中文文本分词、数据清洗、词频统计、相关分析等文本挖掘的方法，分析鼻炎的相关用药，发现玉屏风散在鼻炎并发咽炎的治疗中应用较广［9］。将这种方法用于分析中医治疗肺癌的规律，发现人参与麦冬的组合、黄芪与白花蛇舌草组合、黄芪与沙参组合，在临床治疗中出现的频率较高［10］。

李建生等［11］利用已经建立的现代名老中医肺病数据库（计算机软件著作权编号0430655）和中医肺病数据库，应用聚类分析和二元相关分析的方法，发现肺气阴两虚证常用方剂有麦门冬汤和炙甘草汤，常用药物有麦冬、甘草、半夏，常用药对有熟地黄与石斛、枇杷叶与石膏、枇杷叶与熟地黄；肺阴虚证常用方剂为麦门冬汤，常用药物有麦冬、甘草、南沙参；常用药对有生地黄与党参、麦冬与半夏、知母与化橘红；痰热壅肺证常用方剂为千金苇茎汤，常用药物有苦杏仁、川贝母、甘草，常用药对为竹茹与芦根、桔梗与枳壳、川贝母与枇杷叶；肺气虚证常用方剂为独参汤，常用药物为黄芪、白术，常用药对有黄芪与牡蛎、丹参与当归、太子参与白术；肺胃阴虚证常用方剂为现代名老中医自拟方，常用药物有茯苓、甘草、川贝母，常用药对有砂仁与莲子、半夏与化橘红、陈皮与南沙参；痰瘀阻肺证常用方剂为香附旋覆花汤，常用药物有半夏、党参、红花，常用药对为丹参与赤芍、丹参与桃仁、枇杷叶与百部。

上述研究所确定的方剂或药物组合，可以直接作为下一步方剂组分的研究目标。另外，也可以根据中医对某种疾病的认识，如肺肾气虚是慢性阻塞性肺疾病稳定期的常见证之一［12］，治则为补益肺肾，纳气平喘，选择符合治则又出现频率较高的药物，以君臣佐使重新组合，组成新的方剂，进行下一步的研究。

2 方剂组分的筛选

中医方剂主要以多种药材共同水煮制备成煎剂，然后供给临床应用。若无特殊要求，方剂有效组分的研究应以目的方剂的水煎液为组分分离的对象。来源于自然界的中药材含有复杂的化学成分，包括有效成分、无效成分、毒性、功能成分等。

2.1 组分分离-药效学验证模式有效组分的筛选，首要的工作是分离出煎液中的不同组分。简单、经济的初筛方法，是利用化学分子极性的差异，利用极性不同的溶剂分离、提取不同的组分。常见的方法有水提醇沉法和醇提水沉法，其后，用极性不同的溶剂进一步分离组分。上述分离得到的组分，进行药效学初筛，以母方煎液作为阳性对照，剔除反应阴性的组分，保留阳性的组分。阳性的组分进行色谱分离、大孔吸附树脂分离等方法，进一步分离纯化，不同的组分再次进行药效学验证，直至分离纯化为不同的化学分子，并最终找到反应阳性的单一化合物。这种模式，是从天然药物中筛选有效成分的常规模式，在中药有效成分的发现中应用广泛，标志性的成功案例就是屠呦呦发现的青蒿素。

上述模式可用于方剂有效组分的研究，但也要考虑中医方剂临床应用的特色：即强调多靶点的药物干预和多脏器功能的调节。因此，有效组分的分离不宜过细，达到质量可控的有效部位即可，如生物碱类、多糖类。这种思路，在“单行”方剂的研发中，得到成功的应用，如血栓通（三七的总皂苷组分）等已经作为药典所载的药物上市。

2.2 无效组分剔除-药效学验证模式尽管组分分离-药效学验证模式是目前方剂有效组分筛选中通用的方法，也能从方剂中找到药效强、针对主要疾病的组分，阐释方剂君药作用的物质基础。但这种方法割裂了方剂中不同组分之间复杂的交互作用，不能阐释复杂组分相互之间的协同作用、减毒作用及拮抗作用等重要信息。组分剔除-药效学验证模式对此进行改良［13］，能够在一定程度上揭示方剂中复杂组分之间的交互作用。

该方法将方剂煎液分离成多个组分，相应的去除了某个组分的剩余组分，组分、剩余组分与煎液的关系表述如下：

F（煎液）-F（n）组分＝F（n）剩余组分

剩余组分和煎液同时进行药效学实验，得到相应的效应强度（S）。结果进行方差分析：第一步，药物组与对照组进行方差分析，计算各药物组与对照组之间的P值，标记为P（x）（n）；第二步，计算各药物组与煎液组之间的P值，标记为P（y）（n）；第三步，根据药效结果和前两步的结果，按照下列关系式进行判断：①S（煎液）＞S（a）剩余组分，且P（y）（a）剩余组分＜0.05，则组分a是方剂的有效组分；②S（煎液）＞S（b）剩余组分，且P（y）（b）剩余组分＞0.05，但P（x）（煎液）＜0.05且P（x）（b）剩余组分＞0.05，则组分b是方剂的有效组分；③S（煎液）＜S（c）剩余组分，且P（y）（c）剩余组分＞0.05，但P（x）（c）剩余组分＜0.05，需要再次实验证明被剔除的c组分是否是方剂的有效组分；④S（煎液）＜S（d）剩余组分，且P（y）（d）剩余组分＜0.05，则组分d是无效成分，剩余组分间可能存在协同增效的相互关系。

如果目的方剂煎液分成了上述4个组分，则可判断出组分a是方剂的“君”组分，组分d是无效组分，应剔除。除去d后的剩余组分包含a、b和c，可能存在协同作用。再次进行试验，设组分a组、剔除d的组分组和煎液组，如果剔除d组分组的效果显著高于a组，P值小于0.05，则可认为组分a、b和c配伍，存在协同增效的交互作用。

俞凌燕等［13］应用组分剔除-药效学验证法研究参麦方对环磷酰胺化疗S180荷瘤小鼠的增效作用，发现人参二醇抑瘤率最高，从而找到了方中君药的有效组分；人参二醇、人参三醇和麦冬多糖合用，具有协同增效作用；麦冬皂苷是无效组分，应剔除。上述结果，从辅助环磷酰胺抑瘤的角度，清晰地阐明了参麦方的君药组分（人参二醇）和无效组分（麦冬皂苷）；初步证明人参二醇等3组分合用的协同增效作用，利于下一步的方剂配伍的研究。

2.3 反向药理学模式随着对疾病发生发展过程的深入认识，发现某些蛋白质表达的变化是制约或促进疾病进展的关键因素。随着基因组学、蛋白质组学等学科的进步，持续不断的基因序列和蛋白质序列及结构等信息被发现，生物信息学处理、运算这些信息，识别出与疾病密切相关的蛋白质分子，这些分子成为药物研究的靶标。由此，一种新的筛查药物的新方法—反向药理学形成并得到了应用。

应用反向药理学筛选药物组分，主要的步骤如下［14］：第一步要确定药物作用的靶蛋白分子。根据配体-受体理论，这些决定了疾病发生、发展的蛋白质分子相当于受体，能够与之结合并产生一定相互作用的化合物分子，才可能成为可能的药物。第二步是用这些蛋白质作为“鱼饵”，测试待筛化合物是否与之结合，并影响其表达变化；这个过程也称为“配体钩钓”。第三步，那些被“钓”到的化合物分子，再进行药效学、毒理学和临床药学等研究。

反向药理学适合复方或草药初提物筛选有效组分。原因在于这些初提物（如方剂的水煎剂）已经临床应用较久，治疗的疾病或症状清楚，靶蛋白探寻的目标较为明确。但这些初提物含有复杂的组分，传统的组分提取-药效学筛选费时耗力。借助反向药理学发现靶蛋白的变化，根据其推导的配体分子结构，查询相应的植物化学成分数据库，较快确定可能的有效组分范围，提高筛选效率。

芪苈强心胶囊由黄芪、人参、葶苈子等十余种中草药提取、制备，是一种上市的治疗心衰的中成药，含有复杂的组分。Fu Junzeng等［15］检测药物治疗心衰大鼠血清中9种生物蛋白和147种代谢产物，借助于KEEG数据库和Boehringer代谢图等生物信息学分析技术，推导药物的效应涉及肾素-血管紧张素-醛固酮系统、溶血磷脂酸/溶血磷脂酸环状类似物通路等复杂体系的调节，确定氧脂素类（oxylipins）等是药物作用的靶蛋白，为进一步筛选复方中的有效组分缩小了范围。龙血竭是傣族常用的一种草药，具有止痛功效。刘向明等［16］设想龙血竭镇痛的可能靶蛋白是感觉神经元中特异的电压门控钠通道。以大鼠DRG细胞的TTX-S和TTX-R钠通道为靶蛋白，观察药物干预后，通道电流的变化。结果发现，总提取物及有效成分龙血竭素B调节TTXS的电流；尽管提取物调节TTX-R的电流，但未发现任何一种成分有此作用，而剑叶龙血素A、剑叶龙血素B和龙血素B的组合物具有类似的调节作用。该发现初步发现了龙血竭镇痛的有效组分。

3 计算机虚拟筛选的应用

3.1 类药性筛选在新药的研发过程中，过去人们重视所筛查化合物分子的靶点选择性和活性强度，忽视其药代动力学性质和生物利用度的先期评估，导致这些问题在研发后期（如临床研究阶段）出现，造成研发经费的激增甚至研究的终止，形成人力和物力的浪费［17］。为了规避上述弊端和减少新药研发的风险，基于对已知药物分子化学结构、物理化学性质和生物学特性等的归纳总结，人们总结出它们的某些经验性特征，提出了类药性的概念并应用于早期的筛选化合物的药代动力学性质及其生物利用度的预测。其中，Lipinski类药五原则已经成为筛选的重要标准［18-20］，该原则认为：化合物的分子量小于500道尔顿；化合物结构中的氢键给体（包括羟基、氨基等）数量不超过5个；化合物中氢键受体的数量不超过10个；化合物的脂水分配系数的对数值（logP）在-2-5之间；以及化合物中可旋转键的数量不超过10个。随着人们对药物化合物分子类药性认识的深入，该原则也在不断地优化。

中草药药物分子的化学结构具有一些自身的特点。数十年来，国内的研究也积累了丰富的结构、生物利用度、药代动力学等数据。基于此，王永华等［21］开发出中药系统药理学研究平台，逐渐完善形成具有自主知识产权的系统药理学分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），在植物药/中药研究中得到了广泛的应用。该软件中的两个工具：类药性（Drug-like，DL）和口服生物利用度（oral bioavailability，OB））在复方筛选中得到了普遍的应用。

金银花与连翘是治疗温病常用的组合，在复方配伍中属于相须，临床应用广泛。吴嘉瑞等［22］应用TCMSP，检索到金银花和连翘含有365个化合物分子。系统可显示出每个成分的OB值和DL值，以OB＞50%和DL＞0.18作为筛选条件，得到16个候选化合物。丹参与三七是另一组临床常用的治疗血瘀证的经典药对。师帅等［23］应用TCMSP，从中查询到312个化合物分子，以该软件推荐的ADME参数进行筛选，即：OB≧0%和DL≧0.18，得到73个候选成分。丁燕等［24］应用TCMSP，从药食同源的15种中药（茯苓、莲子、山楂、枸杞子等）找到1502个化合物分子，按照OB≧0%和DL≧0.18筛选，得到361个候选成分。

3.2 靶点-分子对接筛选药物分子与体内特定蛋白（靶蛋白）的结合，是药物产生效应的基础。这种结合类似于配体-受体间的相互作用，具有一定的规律性，是结合分子间空间结构匹配和能量匹配综合作用的结果，受到结合分子间静电作用、氢键作用、疏水作用及空间构象等的影响。通过对分子构象、分子间作用力的计算，可以预测药物与靶蛋白之间的结合程度，逐渐形成了分子对接技术。目前，以某个或某些靶蛋白作为受体，借助分子对接技术计算不同化合物分子与之结合的程度，按照程度的高低进行筛选，从中药复方的复杂成分中获取候选化合物，已经成为复方组分筛选的重要策略之一。

雌激素类药物是防治绝经后妇女骨质疏松症的常用药物，但长期应用不良反应较多。药食两用的某些中药临床上用于治疗骨质疏松症，但其有效组分和作用靶点尚未阐明。丁燕等［24］选择15种药食同源的中草药；以11个雌激素样蛋白作用受体，应用分子对接技术分析药材的1502个化合物与受体的结合，以对接评分≧5为标准，找到336个潜在活性成分。随后建立的化合物-靶标蛋白网络进一步显示黑芝麻和枸杞的潜在活性成分与靶蛋白的作用最为密切。借助分子对接技术，不仅发现了潜在的活性成分和揭示出雌激素样受体干预是某些药食两用中药治疗绝经后妇女骨质疏松症的可能内在机制，而且证实了黑芝麻和枸杞在该病治疗中的价值。林桂源等［25］查询了78种降血糖中药，找到了2401种化合物分子。借助于DrugBank数据库，确定了7个糖尿病治疗相关蛋白作为分子对接的靶蛋白。在Sybyl软件的Surflex-Dock模块，将化合物分子分别与靶蛋白进行柔性对接，利用Surflex-Dock模块的Total-Score打分函数对化合物分子与靶标的相互作用进行评分，设置7分为阈值。结果发现：52、28、32、150、47、41和33个成分分别与二肽基肽酶-Ⅳ、糖原合酶激酶-3、过氧化酶增殖因子活化受体γ、α-葡萄糖苷酶、葡萄糖激酶、钠-葡萄糖共转运蛋白2和血管紧张素转化酶较好结合。该结果对糖尿病治疗新药的研究与开发具有一定的参考价值。

3.3 网络药理学的应用当前，复杂性疾病成为威胁人类健康和生命的重要疾病。人们认识到这类疾病由多个基因或分子位点参与，受到环境因素的影响，表型差异较大。传统的单一分子靶点的高特异性药物治疗这类疾病，效果不佳。从网络药理学的角度，正常条件下，人体的某项生命活动处于众多的蛋白质、基因及其他分子表达和功能所形成的网络的平衡状态，复杂疾病导致该网络平衡的破坏而非网络中某个单一靶点的异常，改善或恢复该网络的平衡是药物产生治疗效应的基石。网络药理学不仅能够预测中药复方复杂的作用机制，也可用于有效组分的筛选。陈浩等［26］在TCMSP网上查询栀子，搜索到98个化合物，经过类药性筛选后，得到21个候选化合物。将21个化合物与其作用靶点导入Cytoscape软件中，构建活性成分-靶点网络，按照自由度大小筛选出核心成分，依次为槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、熊果酸、西红花酸、欧前胡素、丁香脂素、京尼平、亚油酸乙酯、芦丁和齐墩果酸。如果将栀子活性成分与胆汁瘀积疾病靶点构建成分-靶点-疾病网络，筛选出核心网络，并从中筛选出7个核心成分，依次为豆甾醇、山柰酚、β-谷甾醇、槲皮素、欧前胡素、西红花酸和熊果酸。综合两种筛选模式可以看出，上述7种成分与栀子治疗胆汁瘀积性疾病关系更为密切，它们之间相互作用的配伍关系的研究，有助于阐释栀子作用的内在规律。

3.4 计算机虚拟筛选技术组合的应用上述筛选复方中有效组分的计算机虚拟技术，根据筛选目的，可单独应用，但更多的是组合在一起，序贯使用。

西黄方用于乳腺癌的治疗，已有数百年的历史，该方由乳香、没药、牛黄和麝香组成。Hao J等［27］通过Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology（TCMSP）数据库（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）查询上述4药的化学成分，通过Lipinski’s原则对上述化合物进行类药性筛选，得到候选化合物。将候选化合物代入ChemMapper（http：//lilab.ecust.edu.cn/chem mapper/）中，预测西黄方作用的靶点，建立西黄方成分靶点数据库。从Therapeutic Target Database（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd＿home.asp）和其大量的引用研究文献中，筛选得到120个乳腺癌靶点，建立乳腺癌靶点数据库。从乳腺癌靶点数据库和西黄方成分靶点数据库中，找到相同或相似的乳腺癌靶点（交集靶点）。应用Cytoscape software建立成分与交集靶点的相互关系，接着用CentiScaPe plugin计算这些关系的拓扑学参数，以total predicted scores＞0.5和single predicted score＞0.01作为筛选条件，建立各单药主要活性成分与靶点的关系；从中发现最重要的两个靶点是雌激素受体ɑ（ERɑ）以及热休克蛋白90（HSP90）；在SystemsDock中，分别进行活性成分与两个靶点的分子对接。结果发现，麝香和牛黄作用微弱，西黄方中的抑制乳腺癌的药物是乳香和没药。没药的主要活性成分是没药甾酮类、没药醇类，共同的靶点为ERɑ，其他涉及的靶点有Akt、热休克蛋白90等，活性成分具有共同的甾环结构环戊烷并氢化菲。乳香的活性成分为乳香酸类，共同的靶点是热休克蛋白90，共同的化学结构是五环三萜。

在随后进行的实验中，等温滴定两热法证实没药甾酮（Guggulsterone，GS）与ERɑ之间结合紧密，结合力类似于雌二醇。GS、20α-hydroxy-4-pregnen-3-one（20αHP）、fulvestrant和tamoxifen，对ER阳性表达的乳腺癌细胞增殖有抑制效果，但对阴性表达的细胞增殖，如SKBr3或MDA-MB-231，没有影响。乳香中的活性成分（Acetyl-β-boswellic acid，Acetyl-α-boswellic acid和β-boswellic acid）对上述4种肿瘤细胞的增殖，均有抑制作用且不同细胞间差异不明显，类似于HSP90的抑制剂tanespimycin（17-AAG）。

迄今为止，人们掌握了许多中药材中所含化学成分的基本信息，知晓一个复方中所含的几乎所有化合物分子。无论是组分分离-药效学验证模式还是无效组分剔除-药效学验证模式，对一个含有数百至上千的成分进行药效学筛选，都将是低效的方式。网络药理学通过建立组方中的化学分子作用靶标和疾病靶标，通过两者的交集确定药物作用的靶分子，建立成分-靶分子网络。借助网络分析技术，找出最为关键的靶点及组分，解决了候选分子及靶点难以选择的难题。随后根据靶点对候选分子进行分子对接、类药性等筛选，进一步提高了筛选的成功率。因此，上述虚拟筛选技术的联合应用显著减少了化合物筛选的时间、降低了无目的筛选实验所导致的人力和物力消耗。与之前常常用于多成分化合物筛选的高通量法比较，虚拟筛选后所进行的活性筛选实验，得到5-30%的阳性率，远远高于高通量筛选的0.01-0.1%的阳性率［28］。因此，虚拟筛选技术在中药复方研究中的应用日益广泛［27，29-31］。

4 启示与展望

上述文献的回顾和分析，显示出：①先期开展方剂组分的计算机虚拟技术筛选，在未来的研究中，可能成为不可避免的步骤。②数据的分析和应用，成为方剂组分筛选的关键。

但目前的数据存在某些问题，某些组分信息较少甚至没有，反映了组分信息尚未满足方剂组分筛选的需要。另一方面，需要避免噪音信息的干扰。笔者发现某些组分的阳性研究报告或论文存在结果不能重复的问题。显然，这些阳性信息的纳入分析，可能导致整个分析结果的失准，甚至错误，有必要加强输入信息的质量控制。最后需要指出的是：计算机虚拟技术筛选，尽管成为组分筛选的重要方法，但不能取代药理学研究结果。药理学实验结果仍然是判断方剂有效组分筛选结果最为可靠的标准。