柿叶化学成分研究（Ⅱ）

乔金为，张 伟 ，黄顺旺，宋少江，许凤清 ，黄肖霄，吴德玲 *

（1.安徽中医药大学第二附属医院，安徽 合肥230061；2.安徽省现代中药重点实验室，安徽 合肥230012；3.中药饮片制造新技术安徽省重点实验室，安徽 合肥230012；4.沈阳药科大学 中药学院，辽宁 沈阳110016）

柿叶为柿树科植物柿Diospyros kaki Thunb. 的新鲜或干燥树叶[1]，始载于《滇南本草》。柿叶在全国均有分布，资源丰富。沈华等[2]以黄酮类化合物芦丁在柿叶中不同季节含量在8 月最高，推断为柿叶最佳采收时间。现代研究发现柿叶中主要含有黄酮、萜类、醌类、香豆素等多种化学成分，具有镇咳、止血、抗菌消炎、抗癌防癌等生理活性[3-4]。此外，柿叶含有较为丰富的营养物质，目前市场上已有利用柿叶加工制成的柿叶保健茶、柿叶奶茶、柿叶饮料、柿叶晶等一系列功能性保健食品[5-6]。现在临床主要用于降压、治疗冠心病、心绞痛及胃溃疡出血、肺结核出血、功能性子宫出血等病症[6]。本课题组前期对柿叶化学成分研究发现了柿叶中含有新型环烯醚萜化合物以及多种酚酸类化合物[7-8]，为了进一步阐明柿叶的物质基础，本研究对柿叶乙酸乙酯部位继续进行了分离鉴定，得到8 个同类型倍半萜类化合物，其中化合物（6R,9R）-3-oxo-αionol β-D-glucopyranoside （1）; corchoionoside C（2）;（E）-4-[3'-（β-D-glucopyranosyloxy）butylidene]-3, 5, 5-trimethyl-2-cyclohexen-l-one（3）; （Z）-4-[3'-（β-D-glucopyranosyloxy）butylidene]-3, 5, 5-trimethyl-2-cyclohexen-l-one（4）； leeaoside （8）为首次从柿叶中分离得到。

1 材料

Bruker AV-400 型 和 Bruker AV-600 型 核 磁 共振波谱仪（ 瑞士 Bruker 公司）；质谱用Q-Tof mass spectrometer 型 质 谱 仪（Bruker Daltonics, CA）；LC-20AD 型高效液相色谱仪（日本岛津），YMC 型色谱柱（S-5μm 12 nm；250 mm × 20.0 mm 和250 mm×10.0 mm）；Dr Flash-II 型中压制备液相（上海利穗化工科技有限公司），色谱柱为RP-18 gel（Merck, Darmstadt, Germany） 预装柱；EYELA SB-1100 型旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社）；柱色谱硅胶（200 ～ 300 目）和薄层色谱用硅胶G、GF254（青岛海洋化工厂）；凝胶Sephadex LH-20（25 ～ 100 μm，GE 公司）；试剂均为分析纯或化学纯；显色剂为香草醛-硫酸-乙醇溶液（喷后105 ℃加热显色）或碘蒸气显色。

柿叶药材购自亳州药材大市场，产地为安徽省蚌埠市。经安徽中医药大学方成武教授鉴定为柿树科植物柿Diospyros kaki Thunb.的干燥叶。标本（SY-20140510001）存放于安徽中医药大学药物化学教研室。

2 提取分离

取柿叶50 kg，参照“流浸膏与浸膏剂”项下的渗漉法（《中国药典》2020 年版一部附录I O）及文献调研的基础上进行渗漉提取，减压浓缩，得到稠浸膏［密度为1.10 ～ 1.05（80℃热测）］。浸膏水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位和乙酸乙酯部位。取乙酸乙酯部位（950 g）经硅胶柱色谱以二氯甲烷-甲醇（100 ∶0、20 ∶1、10 ∶1、5 ∶1、3 ∶1、1 ∶1、 0 ∶100）梯度洗脱得五个流份Fr.1 ～ Fr.5，取Fr.2 （285 g） 经聚酰胺柱以甲醇-水（0 ∶100、30 ∶70、60 ∶40、100 ∶0）洗脱得Fr.2-1 ～ Fr.2-4，对Fr.2-1（85 g）部 分 以 甲 醇- 水（10 ∶90、20 ∶80、40 ∶60、60 ∶40、80 ∶20、100 ∶0）为洗脱剂，反相硅胶（ODS）中低压色谱柱分离得6 个子流份Fr.2-1-1 ～ Fr.2-1-6，取Fr.2-1-4 （500 mg）分别经制备HPLC（40%甲醇-水，流速：8 mL/min）制备得化合物1 （13 mg），6 （11 mg）。取Fr.3 （392 g） 经聚酰胺柱以甲醇-水（0 ∶100、30 ∶70、60 ∶40、100 ∶0）洗脱得Fr.3-1 ～ Fr.3-4，取Fr.3-1 （100 g）部分以水为洗脱剂经凝胶柱色谱分离得到A、B 两部分，取Fr.A（65 g）经ODS 柱以甲醇（20 ∶80、40 ∶60、60 ∶40、100 ∶0）为洗脱剂得4 个流份Fr.A-1 ～ Fr.A-4，Fr.A-2（12 g）经硅胶柱色谱以二氯甲烷∶甲醇梯度洗脱得6 个流份Fr.A-2-1 ～ Fr.A-2-6，取Fr.A-2-1（1.3 g）经制备HPLC（20%乙腈-水，流速：8 mL/min）制备得化合物2（6.9 mg），Fr.A-2-3（1.2 g）分别经制备HPLC（40%甲醇-水，流速：8 mL/min）制备得化合物5（8 mg）、3（8 mg），Fr.A-2-5（900 mg）分别经制备HPLC（38%甲醇-水，流速8 mL/min）制备得化合物7 （15 mg）、4（21 mg）。取Fr.B（35 g）经MCI 柱 以 甲 醇∶水（20 ∶80、40 ∶60、50 ∶50、60 ∶40、100 ∶0）为洗脱剂得5 个流份Fr.B-1 ～ Fr.B-5，Fr.B-4（6.3 g）经硅胶柱色谱以二氯甲烷∶甲醇梯度洗脱再经薄层检识共得5 个流份Fr.B-4-1 ～ Fr.B-4-5，取Fr.B-4-4（1.1 g）经 制 备HPLC（60%甲醇-水，流速：8 mL/min）制备得化合物8（16 mg）。

3 化合物鉴定

化合物1 白色无定型粉末（甲醇）；HRESI-MS m/z: 393.21 [M + Na]+（计 算 值393.19）；1H NMR （DMSO-d6, 400 MHz） δ：5.81 （1H, s, H-4），5.74 （1H, dd, J = 15.3, 6.7 Hz, H-8），5.51 （1H, dd, J = 15.3, 6.7 Hz, H-7），4.37 （1H, p, J = 6.4 Hz, H-9），4.11 （1H, d, J = 7.7 Hz, H-1′），3.64 （1H, dt, J = 18.5, 9.3 Hz, H-5’），3.42 （1H, dd, J = 11.7, 5.9 Hz, H-4′），3.07 （1H, t, J = 7.0 Hz, H-3′），3.02 （1H, d, J = 8.4 Hz, H-2′），2.98 （1H, d, J = 5.0 Hz, H-6a′），2.94 （1H, d, J = 3.5 Hz, H-6b′），2.62 （1H, d, J = 9.5 Hz, H-6），2.39 （1H, d, J = 16.5 Hz, H-2a），1.95 （1H, d, J = 16.5 Hz, H-2b），1.89 （3H, d, J = 0.8 Hz, H-13），1.20 （3H, d, J = 6.5 Hz, H-10），0.96 （3H, s, H-11），0.91 （3H, s, H-12）。13C NMR （DMSO-d6, 100 MHz） δ：197.9 （C-3），161.9 （C-5），135.2 （C-8），129.0 （C-7），124.9 （C-4），100.0 （C-1′），77.1 （C-5′），77.0 （C-3′），73.3 （C-2′），72.2 （C-9），70.1 （C-4′）， 61.1 （C-6′），54.7 （C-6），47.2 （C-2），35.7 （C-1），27.4 （C-12）, 26.7 （C-11），22.9 （C-13），22.0 （C-10）。化合物1的氢谱和碳谱数据与文献[9-10]中报道的（6R, 9R）-3-oxo-α-ionol β-D-glucopyranoside 的波谱数据基本一致，故鉴定该化合物为（6R, 9R）-3-oxo-α-ionol β-D-glucopyranoside。

化合物2 白色无定型粉末（甲醇）；HRESI-MS m/z: 409.19 [M + Na]+（计 算 值409.18）；1H NMR （DMSO-d6, 400 MHz） δ：5.95 （1H, d, J = 15.5 Hz, H-7），5.77 （1H, s, H-4），5.65 （1H, dd, J = 15.5, 6.4 Hz, H-8），4.46 （1H, m, H-9），4.10 （1H, d, J = 7.7 Hz, H-1′），3.65 （1H, dd, J = 10.9, 5.4 Hz, H-5′），3.42 （1H, m, H-4′），3.04 （1H, d, J = 9.5 Hz, H-3′），3.03 （1H, d, J = 9.5 Hz, H-2′），2.96 （2H, m, H-6′），2.55 （1H, d, J = 16.7 Hz, H-2a），2.06 （1H, d, J = 16.7 Hz, H-2b），1.83 （3H, s, H-13），1.19 （3H, d, J = 6.4 Hz, H-10），0.94 （3H, d, J = 3.7 Hz, H-11），0.92 （3H, s, H-12）。13C NMR （DMSO-d6, 100 MHz） δ: 197.4 （C-3），163.8 （C-5），131.7 （C-8），131.5 （C-7），125. 6 （C-4），100.0 （C-1′），77.9 （C-6），77.1 （C-5′），77.0 （C-3′），73.3 （C-2′），72.0 （C-9），70.1 （C-4′），61.1 （C-6′），49.4 （C-2），41.0 （C-1），24.1 （C-12），23.1 （C-11），22.1 （C-10），18.7 （C-13）。经文献检索对比化合物2 的氢谱和碳谱与文献[11]中报道的corchoionoside C 的波谱数据基本一致，故鉴定该化合物为corchoionoside C。

化合物3 白色无定型粉末（甲醇）；HRESI-MS m/z: 393.19[M + Na]+（ 计 算 值393.19）；1H NMR （DMSO-d6, 400 MHz） δ：6.21 （1H, t, J = 6.7 Hz, H-7），5.83 （1H, s, H-4），4.25 （1H, d, J = 7.8 Hz, H-1′），3.86 （1H, dt, J = 11.5, 5.8 Hz, H-9），3.67 （1H, d, J = 11.6 Hz, H-5′），3.44 （2H, m, H-4′），3.14 （1H, m, H-3′），3.04 （1H, dt, J = 15.8, 8.1 Hz, H-2′），3.03 （2H, m, H-6′），2.60 （2H, dd, J = 9.3, 6.4 Hz, H-8），2.26 （2H, d, J = 5.0 Hz, H-2），2.06 （3H, s, H-13），1.24 （3H, s, H-11），1.23 （3H, d, J = 6.5Hz, H-10），1.22 （3H, s, H-12）。13C NMR （DMSO-d6, 100 MHz） δ：197.8 （C-3），155.3 （C-5），141.6 （C-6），132.4 （C-7），124.5 （C-4），102.6 （C-1′），76.8 （C-5′），76.8 （C-3′），74.8 （C-9），73.6 （C-2′），70.1 （C-4′），61.1 （C-6′），53.4 （C-2），37.7 （C-8），36.2 （C-1），28.6 （C-11），28.5 （C-12），21.9 （C-10），21.8 （C-13）。化合物3 的氢谱和碳谱与文献[12]中报道的（E）-4-[3'-（β-D-glucopyranosyloxy）butylidene]-3, 5, 5-trimethyl-2-cyclohexen-l-one 的波谱数据基本一致，故鉴定该化合物为（E）-4-[3'-（β-Dglucopyranosyloxy）butylidene]-3, 5, 5-trimethyl-2-cyclohexen-l-one。

化合物4 白色无定型粉末（甲醇）；HRESI-MS m/z: 393.20 [M + Na]+（计 算 值393.19）；1H NMR （DMSO-d6, 400 MHz） δ：5.88 （1H, t, J = 7.1 Hz, H-7），5.85 （1H, s, H-4），4.24 （1H, d, J = 7.8 Hz, H-1′），3.85 （1H, m, H-9），3.67 （1H, d, J = 10.5 Hz, H-5′），3.44 （1H, dd, J = 11.6, 5.6 Hz, H-4′），3.12 （1H, m, H-3′），3.08 （1H, dd, J = 5.6, 1.7 Hz, H-2′），3.04（1H, m, H-6′a），2.94 （1H, m, H-6′b），2.49 （2H, m, H-8），2.21 （2H, d, J = 2.6 Hz, H-2），2.20 （3H, d, J = 1.0 Hz, H-13），1.20 （1H, d, J = 6.2 Hz, H-10），1.12 （3H, s, H-11, 12）。13C NMR （DMSO-d6, 100 MHz） δ：197.7 （C-3），155.7 （C-5），142.7 （C-6），127.9 （C-7），127.9 （C-4），102.6 （C-1′），76.8 （C-5′），74.9 （C-9），73.6 （C-2′），70.1 （C-4′），61.1 （C-6′），52.3 （C-2），40.4 （C-8′），36.4 （C-1），27.8 （C-11），27.6 （C-12），24.2 （C-10），21.7 （C-13）。经文献检索对比化合物4 的氢谱和碳谱与文献[12]中报道的（Z）-4-[3'-（β-D-Glucopyranosyloxy）butylidene]-3, 5, 5-trimethyl-2-cyclohexen-l-one 的波谱数据基本一致故鉴定该化合物为（Z）-4-[3'-（β-DGlucopyranosyloxy）butylidene]-3, 5, 5-trimethyl-2-cyclohexen-l-one。

化合物5 白色无定型粉末（甲醇）；HRESI-MS m/z: 231.14 [M + Na]+（计 算 值231.14）；1H NMR （DMSO-d6, 400 MHz） δ：6.10 （1H, t, J = 6.8 Hz, H-7），5.84 （1H, s, H-4），3.75 （1H, m, H-9），2.48 （2H, t, J = 6.5 Hz, H-8），2.25 （2H, d, J = 6.8 Hz, H-2），2.04 （3H, d, J = 0.7 Hz, H-13），1.23 （3H, s, H-11），1.22 （3H, s, H-12），1.12 （3H, d, J = 6.1 Hz, H-10）。13C NMR （DMSO-d6, 100 MHz） δ：197.9 （C-3），154.9 （C-5），141.6 （C-6），133.2 （C-7），124. 6 （C-4），66.1 （C-9），53.4 （C-2），39.2 （C-8），37. 7 （C-1），8.6 （C-11），28.5 （C-12），23.4 （C-10），21.8 （C-13）。化合物5 的氢谱和碳谱数据与文献[13]中报道的（6E,9S）-9-Hydroxy-4,6-megastigmadien-3-one的波谱数据基本一致，故鉴定该化合物为（6E,9S）-9-Hydroxy-4,6-megastigmadien-3-one。

化合物6 白色无定型粉末（甲醇）；HRESI-MS m/z: 231.14[M + Na]+（ 计 算 值231,14）；1H NMR （DMSO-d6, 400 MHz） δ：5.81 （1H, s, H-4），5.61 （1H, dd, J = 15.3, 5.7 Hz, H-8），5.48 （1H, ddd, J = 15.3, 9.2, 1.0 Hz, H-7），4.71 （1H, s, 9-OH），4.14 （1H, dd, J = 12.1, 6.1 Hz, H-9），2.58 （1H, d, J = 9.2 Hz, H-6），2.32 （1H, d, J = 16.5 Hz, H-2a），1.95 （1H, d, J = 16.5 Hz, H-2b），1.87 （3H, d, J = 1.1 Hz, H-13），1.13 （3H, d, J = 6.4 Hz, H-10），0.95 （3H, s, H-11 ），0.89 （3H, s, H-12）。13C NMR （DMSO-d6, 100 MHz） δ： 197.9 （C-3），162.4 （C-5），139.5 （C-8），124.9 （C-7），124.7 （C-4），66.3 （C-9），54.5 （C-6），47.1 （C-2），35.7 （C-1），27.4 （C-12），26.7 （C-11），24.0 （C-13），23.0 （C-10）。化合物19 的氢谱和碳谱数据与文献[14]中报道（6Z,9S）-9-hydroxy-4,6-megastigmadien-3-one 的波谱数据基本一致，故鉴定该化合 （6Z,9S）-9-Hydroxy-4,6-megastigmadien-3- one。

化合物7 白色无定型粉末（甲醇）；HRESI-MS m/z: 393.21[M + Na]+（ 计 算 值395.21）；1H NMR （DMSO-d6, 400 MHz） δ：5.72 （1H, s, H-4），4.41 （1H, t, J = 5.5 Hz, H-9），4.16 （1H, d, J = 7.8 Hz, H-1′），3.66 （1H, dd, J = 11.6, 3.8 Hz, H-5′），3.42 （1H, dt, J = 16.8, 5.4 Hz, H-4′），3.11 （1H, dd, J = 16.8, 6.5 Hz, H-3′），3.05 （1H, m, H-2′），3.05 （1H, td, J = 8.4, 4.8 Hz, H-6′a），2.91 （1H, td, J = 8.4, 4.8 Hz, H-6′b），2.38 （1H, d, J = 11.0, 5.8 Hz, H-2a），1.97 （3H, d, J = 1.0 Hz, H-13），1.87 （1H, dd, J = 11.0, 5.8 Hz, H-2b），1.87 （1H, t, J = 5.3 Hz, H-6），1.77-1.65 （2H, m, H-8），1.54 （2H, m, H-7），1.16 （3H, d, J = 6.3 Hz, H-10），1.01 （3H, s, H-11），0.94 （3H, s, H-12）。13C NMR （DMSO-d6, 100 MHz） δ：198.1 （C-3），165.9 （C-5），124.2 （C-4），102.5 （C-2′），76.8 （C-5′），76.7 （C-3′），74.9 （C-9），73.7 （C-2′），70.2 （C-4′），61.2 （C-6′），50.4 （C-6），47.0 （C-2′），36.0 （C-8′），35.7 （C-1），28.5 （C-12），26.8 （C-11），24.7 （C-7），24.2 （C-13），21.6 （C-10）。经文献检索对比化合物7 的氢谱和碳谱与文献[15]中报道的 pipelol A 的波谱数据基本一致，故鉴定该化合物为pipelol A。

化合物8 白色无定型粉末（甲醇）；HRESI-MS m/z: 527.25 [M + Na]+（计 算 值527.25）；1H NMR （DMSO-d6, 400 MHz） δ：5.72 （1H, s, H-4 ），4.86 （1H, d, J = 2.8 Hz, H-1′′），4.16 （1H, d, J = 7.8 Hz, H-1′），3.83 （1H, t, J = 9.2 Hz, H-3′′），3.81 （1H, m, H-6′b），3.74 （1H, d, J = 2.6 Hz, H-4′′），3.68 （1H, td, J = 12.3, 6.4 Hz, H-9），3.58 （1H, d, J = 9.3 Hz, H-5′），3.41 （1H, m, H-6′a），3.33 （2H, m, H-6′′），3.13 （1H, t, J = 8.8 Hz, H-3′），2.96 （1H, m, H-4′），2.91 （1H, m, H-2′），2.38 （1H, d, J = 17.2 Hz, H-2a），1.97 （3H, d, J = 0.9 Hz, H-13）， 1.87 （1H, t, J = 5.3 Hz, H-6），1.87 （1H, dd, J = 17.2 Hz, H-2b ），1.70 （2H, m, H-8），1.54 （3H, m, H-7 ），1.15 （3H, d, J = 6.2 Hz, H-10），1.01 （3H, s, H-11），0.94 （3H, s, H-12）。13C NMR （DMSO-d6, 100 MHz） δ：198.1 （C-3），165.9 （C-5），124.2 （C-4），109.3 （C-1′′），102.6 （C-1′），78.8 （C-2′′），76.7 （C-3′），75.9 （C-4′′），75.4 （C-5′），75.3 （C-9），73.6 （C-2′），73.3 （C-3′′），70.3 （C-4′），67.7 （C-6′），63.3 （C-5′′），50.4 （C-6），47.0 （C-2），36.0 （C-8），35.9 （C-1），28.5 （C-12），26.7 （C-11），24.8 （C-7），24.1 （C-13），21.6 （C-10）。经文献检索对比化合物8 的氢谱和碳谱与文献[16]中报道的leeaoside 的波谱数据基本一致，故鉴定该化合物为leeaoside。

4 讨论

本研究共分离鉴定8 个化合物，从解析的化合物结构上看其母核都是13 个碳的降碳类倍半萜。其中化合物5 和化合物6 为苷元且互为同分异构体，化合物8 为双糖苷，其余化合物都为单糖苷。化合物1、3、4 互为同分异构体，其中化合物3 和化合物4 仅存在双键构型的差异；化合物2 与化合物1 的区别在于6位碳多了一个羟基；化合物8 与化合物7 比较多了一个阿拉伯呋喃糖。反观化合物的分离流程，化合物均来自聚酰胺柱色谱水洗脱部位，在凝胶柱色谱上多集中在前半部分流份中。各种柱色谱技术有序结合可以分离出目标富集萜类成分，为柿叶进一步研究开发提供依据，同时也为富含萜类和黄酮类成分的中药化学成分研究提供参考。

5 结论

对柿叶提取物的乙酸乙酯溶剂萃取部位运用硅胶、凝胶、聚酰胺以及制备高效液相色谱等手段进行化合物的分离和纯化，对得到的单体化合物通过核磁共振谱（1H,13C-NMR）和质谱分析并与参考文献中的数据进行比对鉴定化合物结构。共分离鉴定了8 个倍半萜类化合物，其母核都是13 个碳原子的降碳类倍半萜，其中，有2 个苷元类化合物，5 个单糖苷和1 个双糖苷。本研究从柿叶的乙酸乙酯部位分离得到的化学成分多为单糖苷及其苷元，后期将对柿叶的正丁醇部位进行进一步研究，期望从中分离得到更多的降碳倍半萜糖苷类化合物。化合物1 ～ 4 以及化合物8 为首次在柿叶中分离得到，更进一步丰富了柿叶的化合物种类，为柿叶的进一步研究提供物质基础研究的理论依据。